BCR-ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突變和PRV-1表達的研究.pdf

1、目的：BCR/ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病(cMPDs)主要包括真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(IMF)。近期，在約90％的PV及一部分ET和IMF患者中發(fā)現了高致病性的獲得性JAK2V617F點突變。JAK2是一種組成性酪氨酸激酶，能激活JAK-STAT信號傳導途徑。polycythemia rubra vera-1(PRV-1)是一種新的造血受體，研究報道在BCK/ABL陰性的cMPDs中P

2、RV-1mRNA有異常高表達。但目前尚不清楚cMPDs中JAK2V617F突變和PRV-1mRNA高表達之間的關系以及二者對cMPDs臨床特征的影響。本研究旨在探討cMPDs中JAK2V617F突變和PRV-1mRNA的表達情況，進一步探討B(tài)CR/ABL陰性的cMPDs的分子生物學發(fā)病機制，期望為JAK2V617F陽性的cMPDs患者提供更為特異的靶向治療藥物奠定理論基礎。 方法：實驗對象包括62例BCR/ABL陰性的cMPDs

3、患者(26例PV、26例ET、9例IMF、1例慢性中性粒細胞白血病)、20例慢性粒細胞白血病(CML)患者、11例急性白血病(AL)患者和12名健康志愿者。BCR/ABL陰性的cMPDs患者為研究組，其他為對照組。追蹤記錄比較各組患者的臨床特征；應用等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)方法檢測各組中JAK2V617F突變發(fā)生率，用DNA測序和聚合酶鏈反應一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)加以驗證和分型；應用半定量逆轉錄

4、聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測各組中PRV-1mRNA的表達情況。 結果： 1、用AS-PCR.方法檢測JAK2V617F的突變情況，顯示在62例BCR/ABL陰性的cMPDs中有44例存在JAK2V617F點突變(陽性率為71.0％)，其中包括23/26例PV患者(陽性率88.5％)、15/26例ET患者(陽性率57.7％)、5/9例IMF患者(陽性率55.6％)和1例慢性中性粒細胞白血病(CNL)患者。而20例

5、CML患者、11例AL患者和12名健康志愿者無一例存在JAK2V617F突變(陽性率均為0.0％)。BCR/ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病中JAK2V617F突變率和其他三組(CML組、AL組和正常對照組)相比均有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。PV組、ET組和IMF組的JAK2V617F突變率也不完全相同，X<'2>=7.049，P=0.029。進一步兩兩組間比較，PV組和ET組的JAK2V617F突變率有統(tǒng)計學意義，X<'2>=6.

6、256，P=0.012。PV組和IMF組比較，突變率的差異無統(tǒng)計學意義，P=0.055。ET組和IMF組JAK2V617F突變率無統(tǒng)計學意義，P=1.000。 2、AS-PCR方法檢測發(fā)現的所有JAK2V617F突變陽性標本和隨機抽取的10例陰性標本，又用DNA測序和PCR-RFLP方法進行驗證，所發(fā)現的突變結果一致。同時將所有44例JAK2V617F陽性的標本根據突變情況分為T/T純合子突變型和T/G雜合子突變型，44例中只有

7、5例PV和1例IMF患者為T/T純合子突變，其余均為T/G雜合子突變。所有突變陰性的野生型為G/G純合子。 3、用RT-PCR技術檢測PRV-lmRNA表達水平。 各組中PRV-lmRNA表達情況： PRV-lmRNA相對表達水平各組資料經正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布，且方差齊。經單因素方差分析F=15.572.P=0.000，各組間PRV-1相對表達水平不完全相同，進一步兩兩組間比較用LSD-t檢驗。

8、在12例健康志愿者中，2例不表達PRV-lmRNA，10例(83.3％)PRV-lmRNA表達陽性，基因表達水平(PRV-1/β-actin)范圍為0.000-0.799，表達水平均數為0.387±0.231。在44例突變陽性的cMPDs患者中，42例(95.5％)表達PRV-lmRNA，基因平均表達水平(PRV-1/β-actin)為0.695±0.274，在18例突變陰性的cMPDs患者中，17例(94.4％)表達PRV-lmRNA

9、，基因平均表達水平(PRV-1/β-actin)為0.403±0.168，JAK2V617F突變陽性組的PRV-lmRNA平均表達水平與JAK2V617F突變陰性的cMPDs組相比差異有統(tǒng)計學意義，P<0.001，且突變陽性的cMPDs患者的PRV-lmRNA表達水平明顯高于CML患者(0.285±0.246)、AL患者(0.262±0.143)和正常對照(0.387±0.231)，P值均<0.001。但是沒有JAK2V617F突變的B

10、CR/ABL陰性的cMPDs患者與CML組、AL組和正常對照組相比，PRV-1表達水平均無顯著差異，P均>0.05。對照組中，CML患者、AL患者與健康志愿者的PRV-1表達水平兩兩比較均無顯著差異，P均>0.05。且BCR/ABL陰性的cMPDs各亞型(PV、ET和IMF)之間兩兩相比，PRV-1 mRNA表達水平也無顯著差異，P均>0.05。 4、JAK2V617F突變陽性組與突變陰性組臨床特征的比較：JAK2V617F突變

11、陽性的PV患者初診時的白細胞計數(平均18.2×10<'9>/L)和血小板計數(平均479×10<'9>/L)顯著高于突變陰性的PV患者(白細胞和血小板平均計數分別為7.6×1010<'9>/L和277×10<'9>/L)，P均<0.05。ET患者中，突變陽性者初診時的血紅蛋白值(平均146g/L)和白細胞計數(平均14.6×10<'9>/L)顯著高于突變陰性者(122g/L和10.9×10<'9>/L)，而且，突變陽性者有較高的并發(fā)癥

12、發(fā)生率，P值均<0.05。IMF患者中，有無突變者的臨床特征無顯著差異，P均>0.05。 結論： 1、真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化患者中有較高的JAK2V617F突變率，在慢性粒細胞性白血病、急性白血病患者和健康志愿者中無一例存在JAK2V617F突變，說明JAK2V617F突變參與了BCR/ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病的發(fā)生，JAK2V617F可作為BCR/ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病的診

13、斷和分類的重要的分子標記。 2、JAK2V617F突變陽性的慢性骨髓增殖性疾病患者PRV-1mRNA有異常過度表達，提示JAK2V617F突變與PRV-1mRNA過度表達有關，可能為JAK2V617F激活了JAK-STAT信號傳導通路所致。 3、用等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)技術檢測JAK2V617F突變，敏感性高，準確、節(jié)資省時，與直接測序所得結果一致。因此，AS-PCR技術可以應用于臨床實驗室檢測JAK