人白細(xì)胞介素15 cDNA協(xié)同優(yōu)化的人乳頭瘤病毒16型E7核酸疫苗治療宮頸癌的初步研究.pdf

1、宮頸癌是婦女因惡性腫瘤而死亡的第二位死因，是威脅婦女健康的大敵。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)，尤其是HPV 16型是宮頸癌的主要致病因子，99％以上的宮頸癌病例都可檢測(cè)到HPV感染。晚期宮頸癌的治療除了手術(shù)放化療以外尚無(wú)良策。那么針對(duì)宮頸癌的病因——HPV感染來(lái)研制預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗來(lái)戰(zhàn)勝宮頸癌已成為人們的普遍共識(shí)，并已取得了一定成果。其中治療性疫苗多選用HPV的兩個(gè)早期基因E6和E7基因作為抗原基因。這兩個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是引起細(xì)胞

2、惡性轉(zhuǎn)化的主要癌蛋白。疫苗的形式多種多樣，包括微生物載體疫苗，蛋白疫苗，DNA疫苗等。大多數(shù)疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都取得了較好的抗瘤效果，部分已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。但目前得到的臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不盡如人意。所以提高治療性疫苗的免疫原性從而增強(qiáng)疫苗的免疫效果十分必要。 本研究是關(guān)于宮頸癌治療性疫苗的研究。研究選用了DNA疫苗這一形式，采用HPV16 E7基因作為抗原靶基因，從增強(qiáng)疫苗免疫原性并消除抗原蛋白轉(zhuǎn)化活性這一角度出發(fā)，對(duì)抗原基因進(jìn)行了一

3、系列優(yōu)化，并將優(yōu)化后的基因與結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白70(MtHSP70)基因相融合作為宮頸癌治療性疫苗的主體，為了增強(qiáng)免疫效果，還選用人白細(xì)胞介素15(hIL-15)基因作為分子佐劑協(xié)同免疫。研究首先構(gòu)建了一系列重組真核表達(dá)質(zhì)粒，使用Western blot，免疫熒光以及ELISA方法驗(yàn)證了這些質(zhì)粒的體外表達(dá)后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了分組免疫，并對(duì)該疫苗激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。具體的疫苗優(yōu)化策略和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．對(duì)H

4、PVl6 E7基因進(jìn)行系列優(yōu)化。首先對(duì)E7基因進(jìn)行g(shù)ene shuffle，即基因切割重排。將E7基因分成a,b,c三個(gè)部分，將中間部分b重復(fù)一次，得到abbc序列，并在該序列的兩端各添加一個(gè)HLA*A0201表位，得到重排的HPV16 E7基因(SHE7)?；蛑嘏藕?，用哺乳動(dòng)物偏愛(ài)的密碼子對(duì)HPV16 ShE7病毒基因進(jìn)行優(yōu)化，并突變了與轉(zhuǎn)化活性相關(guān)的Rb位點(diǎn)和鋅指結(jié)合區(qū)，期望通過(guò)這樣的優(yōu)化策略來(lái)提高表位劑量，增加蛋白表達(dá)量并消除抗

5、原蛋白的轉(zhuǎn)化活性?；騼?yōu)化后，采用人工合成的方法合成了HPV16 E7基因。 2．選用VR1012作為疫苗的真核表達(dá)載體，將優(yōu)化的HPV16 ShE7與MtHSP70基因相融合，構(gòu)建了以HPV16 ShE7/MtHSP70融合基因?yàn)橹黧w的DNA疫苗VR1012-HPV16 ShE7/MtHSP70，同時(shí)構(gòu)建了野生型HPV16 E7基因，單獨(dú)HPV16 ShE7基因和MtHSP70基因的真核表達(dá)質(zhì)粒-VR1012-WE7，VR10

6、12-ShE7，VR1012-MtHSP70。另外還構(gòu)建了兩個(gè)人IL-15的真核表達(dá)質(zhì)粒-VR1012-hIL-15和VR1012-hIL-2S/hI1-15。將上述重組質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過(guò)Western blot和免疫熒光的方法鑒定了WE7，ShE7，ShE7/MtHSP70以及Mt HSP70蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)與定位，通過(guò)ELISA的方法鑒定了IL-15在細(xì)胞中的分泌性表達(dá)。 3．選用PGEX-4T1作為原核

7、表達(dá)載體，構(gòu)建了HPV16 E7基因的原核表達(dá)載體，在E.Coli(BL21/DE3)中表達(dá)了GST-E7融合蛋白并使用親和層析的方法對(duì)該蛋白進(jìn)行了純化。該蛋白擬用于檢測(cè)疫苗免疫后產(chǎn)生的特異性E7抗體，根據(jù)凝膠薄層掃描結(jié)果顯示，蛋白純度達(dá)到75％以上，可以滿足體外免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的要求。 4．用上述構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫。 將6-8周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分為六組：WE7免疫組，ShE7免疫組，ShE7/MtH

8、SP70免疫組，ShE7/MtHSP70+hIL-15免疫組，hlL-15免疫組和空載體VR1012對(duì)照組。雙側(cè)股四頭肌注射接種三次，肌肉注射后進(jìn)行體內(nèi)電穿孔以增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率。在’WE7免疫組內(nèi)增加2只小鼠未進(jìn)行體內(nèi)電穿孔，用于比較體內(nèi)電穿孔的效果。每次每種質(zhì)粒接種100μg，間隔2周。 作為宮頸癌治療性疫苗的研究，免疫原性的檢測(cè)，體內(nèi)抗瘤實(shí)驗(yàn)以及抗瘤免疫機(jī)制的深入研究十分必要。本研究所作的工作為后續(xù)進(jìn)一步深入研究人IL-15