SARS-CoV 7a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能初步研究.pdf

1、SARS是近年來爆發(fā)的一種嚴(yán)重的呼吸道傳染疾病，SARS-CoV是SARS的病原體。基因組測(cè)序結(jié)果顯示，SARS-CoV除編碼冠狀病毒共有的結(jié)構(gòu)蛋白M、E、S和N蛋白外，還存在6個(gè)編碼氨基酸大于50的ORFs，生物信息學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)這些ORFs的同源基因，推測(cè)其中可能存在SARS-CoV致病基因。在SARS-CoV特有的這些ORFs中，ORF7a即為其中之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道在SARS-CoV感染的細(xì)胞中可檢測(cè)到ORF7a的表達(dá)，且其表達(dá)能

2、誘導(dǎo)caspase依賴性的細(xì)胞凋亡，因此有理由認(rèn)為7a可能是SARS-CoV的潛在致病基因。本課題擬對(duì)7a蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能初步研究，以期為揭示SARS-CoV致病的分子機(jī)制提供線索。 用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)7a的細(xì)胞內(nèi)定位及拓?fù)洚悩?gòu)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其定位于高爾基體，N端朝胞漿，C端朝內(nèi)腔。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中注意到轉(zhuǎn)染了7a的HEK293細(xì)胞與空細(xì)胞相比，增殖變得緩慢，推測(cè)其可能有增殖抑制作用。于是構(gòu)建了N端或C端帶有GFP或myc標(biāo)簽

3、的7a真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)7a的表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞增殖，阻止BrdU摻入，提示7a可能起到細(xì)胞周期調(diào)控的作用。于是將7a轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24-60h分別用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)，7a的表達(dá)均能引起細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，且轉(zhuǎn)染COS-7和Vero細(xì)胞也可觀察到相似結(jié)果。 為了找到7a中影響其定位和功能的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了7a基因的系列缺失突變體，并對(duì)其進(jìn)行定位

4、和相關(guān)功能分析，發(fā)現(xiàn)決定7a定位和引起細(xì)胞G0/G1期阻滯以及凋亡的區(qū)域均位于蛋白的44-82個(gè)氨基酸處。 最后，進(jìn)一步探索7a引起細(xì)胞G0/G1期阻滯的機(jī)制。Rb是細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子，可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F并抑制其活性。Rb磷酸化受Cyclin/cdk復(fù)合物的調(diào)節(jié)，Rb高磷酸化后釋放并激活E2F，啟動(dòng)S期基因轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)中我們主要通過Westernblot的方法對(duì)這些影響細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白因子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在

5、HEK293細(xì)胞中，7a的表達(dá)可顯著降低CyclinD3轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，明顯抑制細(xì)胞內(nèi)RbSer795和Ser809/811的磷酸化，而對(duì)CyclinD1、CyclinD2、cdk4和cdk6的表達(dá)沒有明顯影響。提示7a通過下調(diào)CyclinD3的表達(dá)，降低CyclinD/cdk4/6復(fù)合物的活性，抑制Rb磷酸化，Rb磷酸化不足或非磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。 綜上所述，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ORF7a過表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖，