ILK在人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化中的表達變化及意義.pdf

1、目的：人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSC)是從臍帶組織中分離的干細胞，取材簡單易獲取，具有向神經(jīng)細胞分化的能力，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和損傷的細胞移植治療提供一個新的細胞來源。但其分化機制尚不完全清楚。 目前，對UCMSC向多巴胺能神經(jīng)元誘導分化的研究較少，尚無UCMSC向神經(jīng)干細胞樣細胞分化的報道，尚無ILK在UCMSC向神經(jīng)細胞分化中的作用的研究報道。本試驗首先體外誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為臍帶源神經(jīng)干細胞樣細胞hucNSC)

2、，并進一步向神經(jīng)細胞及多巴胺能神經(jīng)元誘導分化，然后研究ILK在UCMSC向神經(jīng)干細胞樣細胞、神經(jīng)細胞誘導分化中的表達變化，siRNA-ILK抑制ILK在神經(jīng)干細胞樣細胞中的表達，檢測抑制ILK能否抑制UCMSC向神經(jīng)細胞的分化，進一步驗證ILK在UCMSC向神經(jīng)細胞的分化中的作用，對UCMSC向神經(jīng)細胞分化的機制進行初步探討。 方法： 1. UCMSC的培養(yǎng)和鑒定 取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，D-Hank's

3、液充分洗滌，將臍帶剪碎至0.5cm3大小組織塊，加入0.1％膠原酶Ⅱ中，37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化18h，將細胞接種于含20％FBS培養(yǎng)基中。取第3代臍帶MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化，制成濃度為3.0×106/mL的單細胞懸液。分別加入抗人的CD44-PE、CD29-APC、CD105-FITC單抗各5μL，流式細胞儀檢測細胞表面分子標志。 2. 體外預誘導UCMSCs向神經(jīng)干細胞樣細胞分化 取第3，4代生長狀態(tài)良

4、好的UCMSCs，按1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)和預誘導。預誘導分為三組：1、bFGF+EGF+B27；2、bFGF+EGF；3、bFGF+EGF+B27+1％FBS。藥物劑量濃度為：bFGF20ng/ml，EGF20ng/ml，B27為2％。在hucNSC形成后繼續(xù)培養(yǎng)2周后用流式細胞儀檢測細胞表面分子標志CD44、CD29、CD105。免疫組織化學檢查分別檢測nestin、CD133、NSE、GFAP、TH表達變化。

5、 3. hucNSC 向神經(jīng)細胞及多巴胺能神經(jīng)元的誘導 將hucNSC細胞球接種于預先放置有多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片的24孔板中進行誘導分化。按在DMEM/F12培養(yǎng)液中加用誘導劑的不同分四組進行誘導：1組10％FBS；2組ATRA；3組GDNF+IL-1β；4組ATRA+GDNF+IL-1β，藥物劑量濃度為：GDNF10ng/ml，IL-1β10ng/ml，ATRA1.0μmol/l。誘導后觀察記錄細胞形態(tài)變化，免疫細胞化學

6、鑒定檢測NSE、GFAP和TH。RT-PCR檢測誘導后細胞NSE、GFAP和TH基因表達結(jié)果。 4. 分化過程中細胞骨架的變化 準備hUCMSC、hucNSC和NC的一組細胞爬片后，0.1％TritonX-100通透5min，加AF488室溫孵育20min，免疫熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。 5. ILK在分化過程中的表達變化 免疫細胞化學檢測ILK在hUCMSC、hucNSC和NC的表達，RT-PCR定性

7、分析，實時熒光定量PCR分析ILK基因表達變化。 6. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾hucNSC中ILK的表達 根據(jù)ILK的NDA序列，由上海吉瑪公司合成siRNA，4組序列供選擇，將hucNSC細胞球培養(yǎng)約2周后，0.01％胰酶消化加機械吹打為單細胞懸液，按照HiPerFector說明書，轉(zhuǎn)染hucNSC，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，實時熒光定量PCR，選出敲減ILK效果最好的siRNA序列。 7. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK

8、后hucNSC的增殖、凋亡和分化 MTT法檢測轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK后hucNSC的增殖；按凋亡試劑盒處理轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK后的hucNSC，流式細胞儀檢測細胞凋亡；用同一誘導方案(在DMEM/F12培養(yǎng)液中加用誘導劑ATRA、GDNF、IL-1β)誘導轉(zhuǎn)染siRNA-ILK和未轉(zhuǎn)染組，免疫組化檢測誘導后細胞表達NSE、GFAP和TH標志物的比例。 結(jié)果： 1. UCMSC的培養(yǎng)和鑒定 在原代培養(yǎng)

9、2天后，可觀察到大量成纖維細胞樣貼壁細胞生長。在2周時，細胞達到80％～90％匯合程度；經(jīng)消化后按1∶2～1∶3的比例傳代的細胞。于接種后數(shù)小時內(nèi)可見其迅速貼壁，約5天后，細胞完全匯合在低倍鏡下呈排列緊密的漩渦樣結(jié)構。培養(yǎng)10代余后的細胞的形態(tài)未見明顯變化，增殖趨勢也相對穩(wěn)定。流式細胞檢測證實這些細胞表達MSCs標志物CD29、CD44和CD105。 2. hUCMSCs形成神經(jīng)干細胞樣細胞 hUCMSCs在加入預誘導液

10、(含bFGF、EGF、B27)后24h內(nèi)，細胞聚集成叢、成堆，由細長梭形變?yōu)榘w為圓形或短梭形，細胞團可由數(shù)個至數(shù)百個不等細胞胞體聚集，周圍伸出不規(guī)則短突起，72h內(nèi)，胞體逐漸融合鏡下分不清單個細胞界限，突起逐漸縮短直至形成懸浮生長的細胞球。含血清或不加B27的培養(yǎng)基無細胞球形成。流式細胞學檢測表明，hucNSC失去原h(huán)UCMSC的細胞表型，CD29、CD44、CD105主要表面標志表達陰性。細胞聚集時nestin即表達陽性，形成的懸浮

11、細胞球nestin、CD133呈強表達，而不表達GFAP、NSE、TH等。 3. hueNSC向神經(jīng)細胞及多巴胺能神經(jīng)元的誘導 在hucNSC培養(yǎng)2周后加入含10％FBS培養(yǎng)基后，細胞球逐漸分解，放射狀伸出細胞，細胞形態(tài)不似原UCMSC，也無神經(jīng)細胞的典型形態(tài)，少數(shù)細胞有較長的突起。加入含有IL-1β、GDNF、RA、的培養(yǎng)液，2～3 d后可見細胞呈長梭形，有的伸出很長的突起，細胞立體感強，胞核清晰，有活力，聚集的細胞逐

12、漸分散生長，10～17d后則許多細胞體積逐漸縮小，逐漸變成小的卵圓形或圓形，不帶突起或向兩極伸出突起，也有的細胞呈短梭形帶有長長的突起或小圓胞體帶有多突起，胞體折光性強，有的胞體不規(guī)則但突起較多，細胞突起可見連接成網(wǎng)。免疫細胞化學分析結(jié)果：加入10％FBS僅出現(xiàn)少量的GFAP分化細胞，加入含有IL-1β、GDNF、RA組GFAP為21.1±3.5％，NSE為57.4±4.3％，TH為9.2％±3.1％，明顯高于單獨應用RA或IL-1β、

13、GDNF各組，p<0.01。RT-PCR分析進一步在mRNA水平上證實了誘導的細胞神經(jīng)標志物表達GFAP、NSE、TH。 4. hUCMSCs向神經(jīng)干細胞樣細胞、神經(jīng)細胞分化過程中細胞骨架的變化 hUCMSCs細胞內(nèi)F-acting呈縱向絲狀規(guī)律排列，hucNSC細胞聚集成球，細胞骨架回縮，呈巢狀，無伸展形態(tài)，誘導后的神經(jīng)細胞胞體F-acting呈網(wǎng)狀，細胞有極性形成，呈軸狀，相鄰細胞細胞骨架可連接成網(wǎng)。 5.

14、ILK在hUCMSCs向神經(jīng)干細胞樣細胞、神經(jīng)細胞分化過程中表達變化 (1) 免疫細胞化學檢測未見hUCMSC中有ILK的表達，hucNSC呈懸浮狀態(tài)細胞中表達ILK，免疫熒光雙標顯示同時表達nestin或CD133；在誘導后神經(jīng)細胞中，ILK繼續(xù)呈強表達， (2) RT-PCR和Real Time PCR檢測結(jié)果：ILK在hUCMSC中微量表達，在轉(zhuǎn)化為hucNSC后ILK表達明顯上調(diào)，進一步誘導的神經(jīng)細胞中ILK表達

15、仍維持較高水平；Real Time PCR定量分析顯示ILK在hucNSC中的表達水平是hUCMSC表達水平的12倍，ILK在誘導后神經(jīng)細胞中的表達水平高于hUCMSC8.6倍，hUCMSC與誘導后的hucNSC、神經(jīng)細胞ILK表達均有顯著差異(卡方檢驗，p<0.05)。 6. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK及轉(zhuǎn)染后hucNSC的增殖、凋亡和分化最佳siRNA序列，正義鏈：5'-GAAUCUCAACCGUAUUCCATT-3'，反義鏈

16、：5'-UGGAAUACG GU UGAGAUUCTG-3'，敲減率在75％以上。 轉(zhuǎn)染ILK-siRNA的細胞增殖活性明顯降低，72h抑止率為64.5±0.5％。轉(zhuǎn)染了ILK siRNA的細胞有11.2％的細胞在早期凋亡階段，9.1％的細胞在晚期凋亡階段或死亡。抑止hucNSC的ILK表達后，繼續(xù)向神經(jīng)細胞誘導分化，結(jié)果GFAP為11.6±1.5％，NSE為16.3±2.1％，TH為1.5％±0.3％，在同一誘導條件下，和對照組相比各

17、種神經(jīng)細胞的分化比例均明顯降低(p<0.05)。 結(jié)論：從人臍帶中可用膠原酶消化法培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細胞，細胞形態(tài)如成纖維樣細胞，可傳代、凍存和復蘇，高水平表達CD29、CD44、CD105細胞表面標志。臍帶間充質(zhì)干細胞在EGF、bFGF、B27的無血清培養(yǎng)基預誘導作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L的細胞球，表達nestin和CD133，能增殖和傳代，在撤去EGF、bFGF、B27加入含血清培養(yǎng)基下，僅能分化為少量表達GFAP的細胞，尚不能