青蒿素類藥物對(duì)孕烷X受體和組成型雄烷受體介導(dǎo)的CYP3A4和CYP2B6轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用.pdf

1、[研究背景]：
　　 青蒿素類抗瘧藥是一類具有內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物。已有研究表明青蒿素(ART)口服吸收迅速但不完全，多劑量口服給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積明顯降低，具有自身誘導(dǎo)代謝現(xiàn)象。而該類藥物的半衰期并沒有隨著血藥濃度的下降而改變，所以推測(cè)該類藥物的自身誘導(dǎo)代謝很可能是通過首過消除機(jī)制產(chǎn)生的。青蒿素類藥物自身誘導(dǎo)代謝現(xiàn)象主要與CYP286有關(guān)，在該酶缺乏的情況下，CYP3A4也起次要代謝作用，且該類藥物還能

2、誘導(dǎo)CYP2C19。鑒于目前青蒿素類抗瘧藥臨床以聯(lián)合用藥為主，且這類藥物存在對(duì)CYP450的誘導(dǎo)作用，因此易發(fā)生藥物間相互作用。這種自身誘導(dǎo)代謝不但會(huì)降低該類藥物的治療效果，還可能影響到與其聯(lián)合應(yīng)用的藥物代謝水平。青蒿素及其聯(lián)合使用的藥物被清除代謝的程度大小取決于青蒿素類藥物對(duì)藥物代謝酶誘導(dǎo)作用的強(qiáng)弱以及藥物的治療窗范圍。
　　 孕烷X受體(HumanpregnaneX。receptor,hPXR)和組成型雄烷受體(Humanc

3、onstitutiveandrostanereceptor，hCAR)是CYP3A4和CYP286基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。當(dāng)外源性化合物進(jìn)入細(xì)胞后，與細(xì)胞核內(nèi)PXR受體的LBD區(qū)域結(jié)合，然后再與RXR結(jié)合形成異源二聚體，從而與CYP3A4基因反應(yīng)元件相結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。利用在此分子機(jī)制上建立起來的hPXR和hCAR介導(dǎo)的CYP3A4和CYP286基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以了解外源性化合物對(duì)CYP3A4和CYP286的誘導(dǎo)作用機(jī)制，預(yù)

4、測(cè)藥物之間的相互作用，減輕或避免由此產(chǎn)生的不良影響。
　　 已有動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)證明，青蒿素類藥物主要經(jīng)過肝臟的攝取被清除，且該類藥物在腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中具有較高的濃度，而上述兩個(gè)生理部位也恰是核受體hPXR和hCAR高表達(dá)部位，因此推測(cè)核受體hPXR和hCAR很可能是介導(dǎo)青蒿素類藥物誘導(dǎo)CYP3A4和CYP286基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，從而可在基因水平闡釋該類藥物的自身誘導(dǎo)代謝機(jī)理。青蒿素類藥物是否通過激活孕烷X受體或者組成型

5、雄烷受體而發(fā)揮對(duì)CYP450的誘導(dǎo)作用，目前尚不清楚。本文選擇該類藥物的母體化合物青蒿素和該類藥物衍生物的共有活性代謝物雙氫青蒿素(DHA)為模型藥物，考察其對(duì)CYP3A4和CYP286的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。闡明其自身誘導(dǎo)機(jī)制對(duì)優(yōu)化該類藥物結(jié)構(gòu)，豐富其自身誘導(dǎo)代謝機(jī)理，指導(dǎo)臨床合理用藥，減少不良反應(yīng)有著重要意義。
　　 [目的]：探討ART和DHA是否能通過激活核受體hPXR或hCAR對(duì)CYP3A4和CYP286產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。

6、r>　　 [方法]：
　　 1.建立雙報(bào)告基因檢測(cè)體系，并通過已知的陽性藥物確證該體系的可靠性；在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化hPXR和hCAR介導(dǎo)的CPY3A4和CYP286轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染體系，提高檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。利用invitrogen脂質(zhì)體2000共同轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒hPXR/hCAR，報(bào)告基因質(zhì)粒CYP3A4/CYP286和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK于HepG-2細(xì)胞中。以hPXR的激動(dòng)劑利福平，hCAR的激動(dòng)劑CITCO為陽性對(duì)照組，以O(shè).

7、1％DMSO為溶劑對(duì)照組；通過調(diào)整三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例，以RIF/DMSO和CITCO/DMSO的比活值，即陽性藥物的誘導(dǎo)倍數(shù)作為優(yōu)化系統(tǒng)靈敏度的指標(biāo)，分別獲得最大比值以表示系統(tǒng)具有最佳靈敏度。
　　 2.通過MTT實(shí)驗(yàn)確定青蒿素和雙氫青蒿素的藥物干預(yù)濃度，選擇小于IC50的藥物濃度作為ART和DHA干預(yù)HepG-2細(xì)胞的測(cè)試濃度。
　　 3.采用報(bào)告基因瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染的方法，分別以青蒿素（2、5、10、30、50、70μmo

8、l/L）和雙氫青蒿素（1、3、5、10、15、20μmol/L）的濃度來干預(yù)己轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的HepG-2細(xì)胞24小時(shí)，考察不同濃度藥物對(duì)CPY3A4和CYP286的誘導(dǎo)作用即濃度效應(yīng)。對(duì)于有誘導(dǎo)作用的藥物濃度，分別干預(yù)細(xì)胞24h、48h、72h以考察藥物誘導(dǎo)作用的時(shí)間效應(yīng)。
　　 4.通過裂解藥物干預(yù)的細(xì)胞，釋放出細(xì)胞編碼的螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，用雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)他們的活性值。用每孔測(cè)得的螢火蟲螢光素值/同孔

9、的海腎螢光素酶活性值得到該孔的校正值。用藥物干預(yù)組每孔的校正值/DMSO孔校正值均值得到每孔的比活值，即藥物組相對(duì)于DMSO組的誘導(dǎo)倍數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)平行轉(zhuǎn)染2次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示誘導(dǎo)倍數(shù)。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.建立了hPXR和hCAR介導(dǎo)的CPY3A4和CYP286藥物誘導(dǎo)體外篩選體系，并通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系提高了系統(tǒng)的靈敏度，且最終確定三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例

10、為pCDNA-hPXR/hCAR150ng∶pGL-CPY3A4/CYP28600ng∶pRL-TK50ng（共800ng）。
　　 2.通過MTT實(shí)驗(yàn)確定了青蒿素的藥物干預(yù)濃度為2、5、10、30、50、70μmol/L，雙氫青蒿素的藥物干預(yù)濃度為1、3、5、10、15、20μmol/L。
　　 3.在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hPXR介導(dǎo)的CYP3A4和CYP286轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，青蒿素2、5、10、30、50、

11、70μmol/L和雙氫青蒿素1、3、5、10、15、20μmol/L等不同濃度干預(yù)HepG-2細(xì)胞24小時(shí)后，與0.1％DMSO溶劑對(duì)照組相比較均未產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用(P＞0.05)，而陽性組利福平的誘導(dǎo)倍數(shù)均在4倍左右（(P＜0.001)）。
　　 4.在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hCAR介導(dǎo)的CYP3A4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，青蒿素在5、10μmol/L兩個(gè)濃度可以通過激活hCAR受體對(duì)CYP3A4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)倍數(shù)

12、分別為3.65±0.28(P＜0.01)和3.42±0.16（P＜0.01）。雙氫青蒿素在1、3、5μmol/L三個(gè)低濃度可以通過激活hCAR受體對(duì)CYP3A4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.78±0.26(P＜0.05),2.89±0.32(P＜0.05),3.14±0.27(P＜0.01).
　　 5．在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hCAR介導(dǎo)的CYP286轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，青蒿素在2、5、10、30μmol/L四個(gè)濃

13、度可以通過激活hCAR受體對(duì)CYP286轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)倍數(shù)分別為3.37±0.24(P＜0.01),3.14±0.31(P＜0.01),3.27±0.29(P＜0.01)，2.96±0.18(P＜0.05)。雙氫青蒿素在1、3、5、10、15、20μmol/L六個(gè)濃度均可以通過激活hCAR受體對(duì)CYP3A轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)倍數(shù)分別為3.24±0.21（P＜0.01）,3.37±0.29(P＜0.01),3.12±0.31

14、(P＜0.01),3.08±0.19(P＜0.01),2.98±0.22(P＜0.05),2.76±0.23(P＜0.05)。
　　 6．在考察具有誘導(dǎo)作用的青蒿素10μmol/L和雙氫青蒿素5μmol/L的濃度時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二者的誘導(dǎo)作用均在48h具有最大值，青蒿素10μmol幾通過hCAR介導(dǎo)，對(duì)CYP286和CYP3A4的最大誘導(dǎo)倍數(shù)分別為3.89±0.23(P＜0.01)和3.97±0.35（P±0.01）。雙氫

15、青蒿素5μmol幾通過hCAR介導(dǎo)，對(duì)CYP286和CYP3A4的最大誘導(dǎo)倍數(shù)分別為4.12±0.35（P＜0.001）和3.94±0.31(P＜O.01)。
　　 [結(jié)論]：
　　 1.青蒿素和雙氫青蒿素在測(cè)試濃度范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)可以激活hPXR受體而誘導(dǎo)CYP3A4和CYP286的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.青蒿素和雙氫青蒿素在不同的測(cè)試濃度范圍內(nèi)均可以通過hCAR受體對(duì)CYP3A4和CYP286的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，并且存