2型豬鏈球菌89K毒力島上毒素——抗生素系統(tǒng)SezAT的發(fā)現(xiàn)與實驗研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype2，S.suis2)是一種重要的人畜共患病病原體。S.suis2感染不僅可致豬的急性關節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎及急性死亡，并且可通過呼吸道和傷口等途徑傳播，導致人類的感染發(fā)病和死亡?？茖W家在丹麥發(fā)現(xiàn)并首次報道人感染S.suis2病例，隨后在世界各地都有報道，但多為散發(fā)病例。然而，1998年和2005年我國江蘇省和四川省分別暴發(fā)大規(guī)模S.suis2感染豬和人類疫情，

2、病人中出現(xiàn)高比例的、國內(nèi)外罕見的鏈球菌中毒性休克綜合征(streptococcal toxicshock syndrome，STSS)，臨床癥狀表現(xiàn)為急性高熱、休克、全身多器官衰竭，病程短而兇險，致死率高，引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生事件。
　　 為了對造成這兩次暴發(fā)感染事件的S.suis2流行菌株的高致病性進行深入研究，我們課題組對1998年江蘇分離的強致病株98HAH12和2005年四川分離的強致病株05ZYH33(兩株均分離自STS

3、S病人)進行了全基因組測序和功能注釋，并與Sanger研究中心公布的標準株P1/7的全基因組序列進行比較，發(fā)現(xiàn)了我國分離的這兩株測序菌株均含有一個89 kb大小的具有毒力島(pathogenicity island，PAI)特征的大片斷，我們將這個特異性的片段命名為89K PAI。隨后對89K PAI行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)89K PAI編碼多個可能與致病相關的成分和結構，如二元信號轉導系統(tǒng)(two-component signaltra

4、nsduction system，TCS)，Ⅳ型分泌樣系統(tǒng)(typeⅣ-like secretion system，T4SS-like)以及一個Zeta毒素等。我們通過實驗證實了這個二元信號轉導系統(tǒng)SalK/SalR參與了細菌的致病過程，而Ⅳ型樣分泌系統(tǒng)則參與了STSS的形成。
　　 近期研究表明該毒力島可以從宿主菌染色體上自發(fā)切離下來，并在染色體上形成類似質(zhì)粒的環(huán)化分子，該環(huán)化分子可作為底物通過Ⅳ型樣分泌系統(tǒng)介導轉移至不含89

5、K毒力島的S.suis2受體菌中。我們試圖通過各種誘導質(zhì)粒消除的方法獲得一株89K毒力島缺失的S.suis2突變株，但始終未能成功。我們推測毒力島上存在一個參與穩(wěn)定作用的結構。進一步生物信息學分析發(fā)現(xiàn)89K毒力島有一個與Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素(typeⅡ toxin-antitoxin)系統(tǒng)，我們將其命名為SezAT(Streptococcus suis epsilonzeta)系統(tǒng)，其中SezA為抗毒

6、素蛋白，SezT為毒素蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)TA系統(tǒng)可在細菌的一些可移動遺傳元件中發(fā)揮穩(wěn)定作用。因此，高致病性S.suis2的89K PAI編碼的SezAT系統(tǒng)很可能參與到89K PAI的穩(wěn)定機制當中。但生物信息學分析結果只能是提示，該TA系統(tǒng)是否具有生物學功能尚需實驗驗證。為此，本文旨在對89K PAI編碼的SezAT系統(tǒng)行活性驗證，并通過同源重組的方法對SezAT系統(tǒng)進行敲除，為下一步驗證其功能和獲得89K PAI缺失突變株奠定基礎。具

7、體實驗內(nèi)容和結果包括以下幾個方面：
　　 1.SezAT系統(tǒng)的生物信息學分析和RT-PCR驗證：我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，89K PAI的負鏈上05SSU0936(sezT)和05SSU0937(sezA)構成一對Ⅱ型TA系統(tǒng)并與Epsilon-zeta(ε-ζ)同源，且兩ORF有一個堿基對的重疊，提示兩ORF共轉錄。為證實兩ORF共轉錄，抽提S.suis2的總RNA行RT-PCR，結果證實兩ORF共轉錄。
　　 2.

8、SezAT系統(tǒng)的活性分析：以05ZYH33基因組DNA為模板，分別擴增SezA和SezT編碼基因的全長片段，分別插入雙啟動子表達質(zhì)粒pJS298中，構建重組質(zhì)粒pJS-AT。通過電轉化的方法導入到大腸桿菌BL21(DE3)，分別用一定濃度的誘導劑IPTG(終濃度為1 mM)和L-阿拉伯糖(0.2%)誘導表達，同時設定不同時間點測定菌液的OD600值，繪制生長曲線。結果顯示，單純誘導表達毒素蛋白SezT可在短時間內(nèi)迅速抑制細菌生長，而同時

9、誘導表達抗毒素蛋白SezA可中和SezT的抑制作用，維持細菌正常生長。提示該SezAT系統(tǒng)構成一對有活性的TA系統(tǒng)。
　　 3.SezAT系統(tǒng)基因敲除突變株的構建：以S.suis05ZYH33的基因組DNA為模板，設計特異性引物，PCR分別擴增sezT單基因和sezAT的左右臂(上下游片段)；同時以穿梭質(zhì)粒pSET2的DNA為模板，PCR擴增壯觀霉素抗性基因SpcR片段，分別將它們克隆到pUC18載體的多克隆位點上，構建成用于靶

10、基因敲除的載體pUC：：SezT和pUC：：SezAT。分別將敲除載體電轉化至05ZYH33感受態(tài)細菌，篩選具有壯觀霉素抗性的S.suis2菌落。通過PCR初篩、多重PCR復篩及測序的方法獲得具有壯觀霉素抗性的sezT基因敲除突變株△sezT，但未能獲得sezAT的敲除突變株。后續(xù)對突變株△sezT基本生物學性狀(生長速率)及致病性研究顯示與野生株無明顯差異，提示SezAT系統(tǒng)不直接參與致病過程。
　　 綜上所述，本研究以S.s

11、uis05ZYH33為研究對象，通過生物信息學分析及RT-PCR檢測提示89K毒力島上SezAT系統(tǒng)的兩基因共轉錄。通過重組質(zhì)粒誘導SezAT系統(tǒng)蛋白過表達證實SezAT系統(tǒng)是有活性的TA系統(tǒng)。通過基因敲除技術獲得了sezT基因缺失突變株△sezT，成功破壞該TA系統(tǒng)結構。突變株△sezT基本生物學性狀研究和小鼠攻毒結果顯示，sezT基因缺失未影響S.suis2的生長和致病性，即提示該TA系統(tǒng)與致病性無直接相關。下一步我們將以sezT基