木材煙霧凝集物對人氣道平滑肌細胞作用的初步研究.pdf

1、【研究背景】
　　我們的前期流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),生物燃料暴露也是導致慢性阻塞性肺疾病(簡稱:慢阻肺)的重要危險因素之一。近年來發(fā)現(xiàn),氣道平滑肌細胞作為氣道的主要結(jié)構(gòu)細胞之一,不僅可以通過細胞數(shù)目增多、體積增大來參與氣道壁增厚,而且在外界因素,如炎癥介質(zhì)、氧化因子等的刺激下,還發(fā)揮自分泌和旁分泌功能,影響周圍的結(jié)構(gòu)細胞和炎癥細胞。氣道平滑肌層的增厚是氣道重塑的重要病理改變,上皮下基質(zhì)增多、上皮下纖維化也參與了慢阻肺氣道的重塑。氣道

2、平滑肌細胞的增殖與凋亡、甚至由壞死而引起的強烈炎癥反應(yīng)共同參與了氣道的損傷與修復,最終引起氣道結(jié)構(gòu)的不可逆重塑。初步研究體外暴露生物燃料凝集物對氣道平滑肌細胞的效應(yīng)如何,對進一步明確生物燃料致慢阻肺機制的基礎(chǔ)研究有重要指導意義。
　　【目的】
　　通過細胞增殖檢測技術(shù)觀察特定濃度木材煙霧凝集物(WSC)處理后的人氣道平滑肌細胞的增殖效應(yīng),并利用Q-PCR和Western blot檢測細胞周期蛋白1(cyclin D1)的含量

3、變化,分析影響細胞增殖的分子機制。通過觀察細胞形態(tài)和數(shù)目變化,膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI)凋亡和壞死檢測技術(shù),觀察WSC處理后人氣道平滑肌細胞的壞死和凋亡效應(yīng)。
　　【方法】
　　一、購買的原代人氣道平滑肌細胞復蘇傳代培養(yǎng),2-8代細胞用于實驗。實驗分組:空白對照組、WSC刺激組、CSC刺激組,WSC和CSC的刺激濃度經(jīng)CCK8細胞毒性實驗初步確定細胞活力增殖范圍,以及細胞增殖抑制初始濃度。
　

4、　二、WSC對HASMCS增殖效應(yīng)的影響:細胞培養(yǎng)和處理24小時后,EDU實驗和流式細胞儀分析細胞周期檢測細胞增殖效應(yīng);Q-PCR和Western blot技術(shù)檢測各組細胞cyclinD1的含量變化。
　　三、WSC對HASMCS壞死和凋亡的影響:不同濃度的凝集物刺激下,光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞數(shù)目。細胞早期凋亡和壞死鑒別試劑膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI),貼壁共染細胞,熒光顯微鏡下計數(shù)

5、凋亡和壞死細胞比例。
　　【結(jié)果】
　　一、在WSC1μg/ml、CSC10μg/ml時,細胞活性分別為[(126±12)％、(142±11)%],較空白對照組[(100±0)%]明顯增加,此時出現(xiàn)細胞活性增殖峰,q值分別為9.33和6.24,P<0.05。暴露劑量達到WSC10μg/ml、CSC60μg/ml時,細胞活性被抑制,分別為85.67%、75.85%,較空白對照組顯著降低,q值分別為5.19和3.63,P<0.0

6、5。
　　二、WSC1μg/ml刺激組細胞增殖指標中的細胞增殖比例和cyclin D1蛋白灰度相對值[(123±20)%,1.31±0.64]顯著高于空白對照[(100±0)%,1.0±0.0],q值分別為5.85和5.91,P<0.05;而S+G2M期細胞比例和cyclin D1 mRNA表達量[(102±4)%、1.18±0.21]較未處理組[(100±0%),1.0±0.0]無顯著差異,P值均>0.05。CSC10μg/ml

7、組的細胞增殖比例、S+G2M期比例、cyclinD1mRNA和蛋白灰度分別為[(204±45)%、(140±6)%、1.48±0.27和1.80±0.25],均顯著大于對照組,q值分別為11.87、16.51、5.38和15.06,同時也高于WSC1μg/ml組,q值分別為9.41、15.35、3.33和9.15,P值均<0.05。
　　三、WSC10μg/ml刺激時,壞死細胞比例增加為[(13.39±0.15)%],高于空白對照

8、組[(1.57±0.41)%]和CSC60μg/ml組[(6.61±1.91)%],q值分別為18.03和10.34,P<0.05;而CSC40μg/ml刺激時,凋亡細胞比例增多為[(61.8±10.6)%],高于空白對照組[(0.0±0.0)%]和WSC10μg/ml組[(1.7±0.4)%],q值分別為17.44和16.95,P均<0.05。
　　【結(jié)論】
　　體外暴露木材煙霧凝集物對氣道平滑肌細胞的作用效應(yīng)與體外暴露于