惡性瘧原蟲MSP1、MSP2基因分型及氯喹抗性相關(guān)基因多態(tài)性的研究.pdf

1、該研究有兩個主要內(nèi)容:一是惡性瘧原蟲海南分離株裂殖子表面蛋白1和2的分型研究.由于不同基因型的惡性瘧原蟲蟲株其致病性、抗原性及對藥物的敏感性都有可能不同,因此對中國海南省惡性瘧原蟲蟲株裂殖子表面蛋白1(MSP1)和2(MSP2)進(jìn)行基因分型,了解其分型特點(diǎn)將為瘧疾疫苗的研制和瘧疾分子流行病學(xué)研究提供有價值的科學(xué)依據(jù).我們首先從采集到的惡性瘧患者的血樣中提取惡性瘧原蟲的基因組DNA,根據(jù)惡性瘧原蟲MSP1和MSP2的不同等位基因型序列分別

2、設(shè)計(jì)了4對和3對引物,然后通過套式PCR分別擴(kuò)增出不同等位基因型的MSP1第2、3區(qū)的部分片段和MSP2的第3區(qū),最后的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后,用紫外分析儀觀察結(jié)果并拍照.結(jié)果55份惡性瘧患者血樣中有52份擴(kuò)增出MSP1基因片段,以MAD20型為主導(dǎo)型(84.6%),K1型為次要型,未檢出RO33型,兩種不同等位基因型混合感染率為15.4%.同時,55份血樣中有53份惡性瘧患者擴(kuò)增出MSP2基因片段,以3D7型為主導(dǎo)

3、型(83%),FC27型為次要型,混合感染率為17%.由此可見,中國海南省惡性瘧原蟲的MSP1存在MAD20型和K1型兩種等位基因型,以MAD20型為優(yōu)勢蟲株;其MSP2存在3D7型和FC27型兩種等位基因型,以3D7等位基因家族為主.二是對惡性瘧原蟲氯喹抗性相關(guān)基因pfmdr 1和pfcrt進(jìn)行多態(tài)性分析.采用套式PCR擴(kuò)增上述目的基因的相關(guān)片斷,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析,觀察是否存在突變位點(diǎn),以確定pfmdr 1基因和pf

4、crt基因中的關(guān)鍵性點(diǎn)突變是否與海南株惡性瘧原蟲產(chǎn)生氯喹抗性有關(guān).對pfmdr 1基因N86Y點(diǎn)突變,用內(nèi)切酶ApoⅠ(可酶切野生型基因)和內(nèi)切酶NspⅠ(可酶切突變型基因)進(jìn)行酶切分析;對pfmdr1基因的D1246Y突變,用內(nèi)切酶EcoRV(可酶切突變型基因)進(jìn)行酶切分析;pfcrt基因中的K76T突變用內(nèi)切酶ApoⅠ(可切開野生型基因)檢測,A220S點(diǎn)突變用內(nèi)切酶BglⅠ檢測.酶切產(chǎn)物均經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后,紫外分析

5、儀觀察結(jié)果并拍照.所測試的45份血樣,經(jīng)體外藥物敏感性測定,有25份血樣出現(xiàn)氯喹抗性,20份為氯喹敏感.基因分析結(jié)果表明,45個樣本中,pfmdr 1基因第86位氨基酸均未發(fā)生點(diǎn)突變,即86位密碼子是Asn而非突變型的Tyr; pfmdr1基因發(fā)生D1246Y突變的樣本有3個,其中1個是抗性株,2個為敏感株;pfcrt基因發(fā)生K76T點(diǎn)突變的樣本有28個,其中20個是抗性株,8個是敏感株;全部樣本的pfcrt基因第220位氨基酸均發(fā)生A