高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠全身毛細血管滲漏和急性肺損傷中的作用的實驗研究.pdf

1、目的:探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠全身毛細血管滲漏(SCL)和急性肺損傷(ALI)中的作用。 方法:胰管逆行灌注人工膽汁的方法復制大鼠AHNP模型。檢測AHNP大鼠血清HMGB1水平的變化規(guī)律；并觀察使用HMGB1釋放抑制劑丙酮酸乙酯(EP)下調(diào)血清HMGB1水平對AHNP大鼠生存時間的影響。 在探討與SCL關系的體外實驗中，觀察HMGB1對單層人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)骨

2、架蛋白——絲狀肌動蛋白(F-actin)含量、分布影響的時間效應和劑量效應；以改良的Boyden小室滲漏模型研究HMGB1對單層HUVEC通透性的影響。在動物體內(nèi)實驗中觀察下調(diào)血清HMGB1水平對AHNP大鼠SCL的影響，包括與水分滲漏和蛋白滲漏的多項指標。 在探討與ALI發(fā)生時PMNs向肺部聚集的關系的實驗中，觀察HMGB1在AHNP大鼠肺部的表達規(guī)律，rHMGB1直接氣管內(nèi)滴入對大鼠肺組織的影響以及抗HMGB1抗體氣管內(nèi)滴入

3、對AHNP大鼠肺損傷的影響，觀察rHMGB1對PMNs內(nèi)皮黏附率和穿內(nèi)皮遷移率的影響，以及rHMGB1對PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18表達的影響。 結果:（略） 結論:HMGB1作為晚期炎癥因子參與了AHNP的全身炎癥反應，且在SCL的發(fā)生中的起到了重要的作用，其作用與影響EC骨架蛋白F-actin的含量和分布導致EC單層通透性增加有關。HMGB1在AHNP大鼠ALI的發(fā)生也中起到了重要作用，除影

4、響毛細血管通透性外，其作用還與上調(diào)PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表達，促進PMNs黏附和游出，增加肺毛細血管的通透性有關。 HMGB1可能是防治SAP患者的CLS和ALI，降低死亡率的有效靶點。 第一部分急性出血壞死性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白1的變化及其意義研究 目的:探討急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠血清高遷移率蛋白-1(HMGB1)水平的變化規(guī)律，以及使用HMGB

5、1釋放抑制劑丙酮酸乙酯(EP)下調(diào)其水平對大鼠生存時間的影響。 方法:采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法復制大鼠AHNP模型。隨機分為正常對照組(Normal組)、急性出血壞死性胰腺炎組(AHNP組)、EP治療組(EP組)。EP組建模12h開始使用EP治療。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組動物血清TNF-αL、IL-1β水平。Westernblot法檢測血清HMGB1水平。 另設實驗組研究EP對AHNP大鼠生存時間的影響。

6、結果:（略） 結論:HMGB1作為晚期炎癥因子參與了AHNP的全身炎癥反應。使用EP下調(diào)AHNP大鼠血清HMGB1水平，能顯著延長動物生存時間。 第二部分高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠全身毛細血管滲漏發(fā)生中的作用研究 目的:探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠全身毛細血管滲漏(SCL)發(fā)生中的作用。 方法:在體外實驗中觀察了HMGB1對單層人臍靜脈內(nèi)皮細胞(

7、HUVEC)骨架蛋白——絲狀肌動蛋白(F-actin)含量、分布的影響以及對單層HUVEC通透性的影響，在動物體內(nèi)實驗中觀察下調(diào)血清HMGB1水平對AHNP大鼠SCL的影響。 1.體外實驗采用成熟的方法分離培養(yǎng)鑒定HUVEC。向單層HUVEC培養(yǎng)液中加入不同濃度梯度(0、10、100、1000、10000ng/ml)的rHMGB1，培養(yǎng)12h以觀察HMGB1作用的劑量效應；加入100ng/ml的rHMGB1，分別培養(yǎng)1、6、12

8、和24h，以觀察HMGB1作用的時間效應。F-actin用羅達明-鬼筆環(huán)肽染色，熒光顯微鏡下觀察F-actin的細胞內(nèi)分布，流式細胞儀檢測HUVEC內(nèi)F-actin的含量。另外，采用Boyden小室滲漏模型、伊文氏藍結合的牛血清白蛋白評價單層血管內(nèi)皮細胞的通透性。在上室中加入0、10、100、1000ng/ml濃度的rHMGB1培養(yǎng)12h以觀察HMGB1作用的劑量效應；或加入100ng/ml濃度的rHMGB1培養(yǎng)1、6、12、24h以觀

9、察HMGB1作用的時間效應。 2.體內(nèi)試驗采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法復制大鼠AHNP模型。隨機分為正常對照組(Normal組)、假手術組(Sham組)、AHNP組、EP組。EP組建模12h開始使用EP治療。檢測與水分滲漏相關的肺系數(shù)、肺濕/干比、腹水量。使用伊文氏藍(EBD)尾靜脈注射檢測與蛋白滲漏相關的胰腺、空腸、回腸、心肌、耳廓組織EBD含量等多項指標。 結果:1.HMGB1通過影響HUVEC骨架蛋白F-acti

10、n的含量和分布導致HUVEC單層通透性增加，而且具有明顯的時間和劑量效應：正常HUVEC單層表現(xiàn)為細胞間連接緊密，圓滑，F(xiàn)-actin主要分布在細胞周邊、胞膜內(nèi)側，隨著HMGB1作用濃度和作用時間的增加，對HUVEC單層F-actin的影響逐漸加重，形態(tài)學上表現(xiàn)為從胞漿內(nèi)出現(xiàn)應力纖維，細胞膜內(nèi)側的F-actin纖維致密斑減少，到大部分細胞發(fā)生肌動蛋白重組，細胞邊緣有絲狀偽足出現(xiàn)，偶有板狀偽足形成，細胞間連接有縫隙形成，更甚者出現(xiàn)大量典型

11、的板狀偽足，最終肌動蛋白絲的溶解、消失；含量上表現(xiàn)為F-actin逐漸減少。HUVEC單層的通透性也出現(xiàn)類似的變化，表現(xiàn)為通透性逐漸增加。 2.下調(diào)血清HMGB1水平可有效減輕AHNP大鼠SCL的程度：建模后24h，EP組血清HMGB1濃度明顯低于AHNP組。EP組大鼠腹水量、肺系數(shù)、肺濕/干比明顯低于AHNP組，胰腺、空腸、回腸和耳廓組織EBD含量明顯低于AHNP組。 結論:HMGB1在AHNP發(fā)生SCL中的起到了重要

12、的作用，其作用可能與影響EC骨架蛋白F-actin的含量和分布導致EC單層通透性增加有關。HMGB1可能是防治SAPSCLS的有效靶點。 第三部分高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠急性肺損傷發(fā)生中的作用研究 目的:探討高遷移率蛋白-1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠急性肺損傷(ALI)發(fā)生中的作用。 方法: 1.胰管逆行灌注人工膽汁的方法復制大鼠AHNP模型。從肺組織

13、TNF-α和HMGB1的mRNA表達水平，支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清TNF-α和HMGB1水平觀察HMGB1在AHNP大鼠肺部的表達規(guī)律。免疫組化檢測肺內(nèi)HMGB1的表達部位。 2.觀察rHMGB1(10、100μg)直接氣管內(nèi)滴入對大鼠肺損傷組織學評分、動脈血氧分壓、肺濕/干比、肺組織TNF-α含量和MPO活性的影響。 3.分離培養(yǎng)大鼠PMNs和PCEC。觀察0、10、100、1000、10000ng/ml濃度

14、的rHMGB1對PMNs內(nèi)皮黏附率的影響。以Boyden小室遷移模型研究上述濃度的rHMGB1對PMNs穿過PCEC遷移到EC下及下室的遷移率的影響。將PMNs與100ng/ml的rHMGB1孵育，流式檢測其對CD11a/CD18和CD11b/CD18表達的影響。 4.觀察抗HMGB1抗體對AHNP大鼠上述ALI指標——大鼠肺損傷組織學評分、動脈血氧分壓、肺濕/干比、肺組織勻漿TNF-α含量和MPO活性的影響。 結果:

15、 1.AHNP大鼠肺組織HMGB1表達上調(diào)：肺組織TNF-α和HMGB1的表達上調(diào)均早于它們在血清中的表達上調(diào)，而在肺組織和血清中TNF-α的表達均早于HMGB1，但HMGB1升高后持續(xù)時間較長。肺組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，ALI的高峰在建模后12h，此時肺組織TNF-α的水平均早已下調(diào)，ALI持續(xù)加重與HMGB1有關。正常大鼠肺組織HMGB1主要表達在肺巨噬細胞(包括肺泡巨噬細胞和肺間質巨噬細胞)和終末支氣管的上皮細胞。AHNP大鼠還

16、在聚集的PMNs中表達。 2.rHMGB1氣管內(nèi)滴入可造成大鼠典型的急性肺損傷表現(xiàn)：10μg和100μgrHMGB1氣管內(nèi)滴入可增加大鼠肺損傷組織學評分、肺濕/干比、肺組織勻漿TNF-α含量和MPO活性，使用100μgrHMGB1的大鼠動脈血氧分壓明顯降低。 3.HMGB1不是PMNs的趨化因子，但可明顯增加PMNs對PCEC的黏附率和穿過PCEC的游出率：隨著rHMGB1濃度的增加，PMNs的黏附率和穿過PCEC的游出

17、率逐漸增加，但對向下室的遷移率無影響。rHMGB1可顯著提高PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表達。 4.HMGB1抗體氣管內(nèi)滴入可減輕AHNP大鼠的ALI表現(xiàn)：降低AHNP大鼠肺損傷組織學評分、肺濕/干比和MPO活性，增加動脈血氧分壓，但對肺組織TNF-α含量無明顯影響。 結論:HMGB1在AHNP大鼠ALI的發(fā)生中起到了重要作用，其作用可能與上調(diào)PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD