脂質體轉染Cyclin D1反義寡核苷酸鏈對肺癌A549細胞影響的研究.pdf

1、肺癌是惡性程度和發(fā)病率均較高的腫瘤之一，腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多步驟的復雜過程。分子生物學研究表明，肺癌的發(fā)生與癌基因激活、抑癌基因失活密切相關，這些基因改變的結果最終導致腫瘤細胞生長的無限制性。在細胞發(fā)生惡性轉化過程中，除癌基因、抑癌基因的正負調節(jié)失控外，細胞周期調控因子也是參與癌變過程的調節(jié)位點。CyclinD1基因是近年來提出的重要原癌基因，其基因蛋白產物在細胞周期關鍵限速點G1-S轉換中起重要正調控作用，使其成為一個有潛力

2、的腫瘤基因治療的理想靶點。 CyclinD1蛋白于1991年被發(fā)現并克隆出其相應的cDNA，該蛋白在細胞周期關鍵限速卡點G1-S期轉移中通過激活cdk4和cdk6，使后者催化一系列關鍵底物(如Rb蛋白)磷酸化，導致轉錄因子釋放，促進DNA合成而發(fā)揮加速細胞增殖的正性調節(jié)作用。CyclinD1是細胞增殖的正性調控因子，參與細胞的DNA合成、復制，促進細胞進入有絲分裂，它的正常表達代表細胞正常的增殖活性。CyclinD1基因的過表達

3、，加速和維持細胞持續(xù)增殖，使細胞獲得永生化，成為具有無限增殖能力的腫瘤細胞。這對于細胞的惡變和腫瘤細胞的形成具有極為重要的意義，如果能夠特異性地抑制腫瘤細胞的CyclinD1活性或抑制其合成，就可以阻斷腫瘤細胞的細胞周期，使其失去無限增殖能力，腫瘤停止生長，甚至自動消退而達到治療目的。 目前反義抑制CyclinD1的合成主要通過以下幾種途徑：1、利用核苷類似物抑制CyclinD1合成；2、利用反義技術抑制CyclinD1活性，包

4、括通過導入CyclinD1編碼基因的反義DNA序列及mRNA序列，抑制其轉錄與合成；3、利用分化誘導劑抑制CyclinD1活性；4、利用拮抗劑減少CyclinD1-CDK4復合物的生成，降低其活性。而通過克隆一段特定的反以cDNA序列(長度約20bp左右，通常為上游啟動序列或核心編碼序列)，干擾CyclinD1蛋白合成，從而導致基因沉默治療肺癌的方法，尚少見報道。 本研究選定人編碼CyclinD1的CCND1基因核心模板區(qū)域(C

5、DS)上游啟動子序列(181-200bp)作為作用靶位，以人工合成并標記熒光蛋白的反義寡核苷酸鏈(ASON)抑制此靶區(qū)，用脂質體共轉染法將其轉染肺腺癌A549細胞株，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染結果并進行鑒定，觀察細胞生長情況，檢測不同時間和濃度下細胞增值特性，用MTT法檢測細胞存活率，流式細胞分析術檢測各細胞周期的比例，在此基礎上，進一步采用RT-PCR、WesternBlot、免疫組化等方法探討ASON作用后肺癌細胞周期基因P16的m

6、RNA和蛋白的變化。 綜上所述，本研究得出以下結論： 1.肺癌組織CyclinD1高表達，CyclinD1蛋白的過表達與NSCLC癌細胞分化程度及各型肺癌TNM分期不相關，提示CyclinD1蛋白過表達可能在肺癌發(fā)生的早期起一定作用；在肺癌組織中p27、P16與CyclinD1蛋白表達呈負相關，三者在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用。 2.ASON能成功轉染肺腺癌A549細胞，且在癌細胞內發(fā)揮抑制作用。