基因重組人組織激肽釋放酶對糖尿病腎病大鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:激肽系統(tǒng)(kinin-kallikrein system,KKS)是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一,由激肽原、激肽釋放酶(kallikrein,KLK)和激肽(kinin)組成,在調(diào)節(jié)血管壁的張力、細(xì)胞增殖及基質(zhì)增生等方面具有重要作用.糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥,也是糖尿病患者死亡的主要原因.糖尿病腎病的主要病理表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚,系膜細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)堆積阻塞腎小球毛細(xì)血

2、管管腔,腎小球?yàn)V過功能喪失.是血管內(nèi)膜功能異常不斷加重的結(jié)果.激肽釋放酶是激肽系統(tǒng)的主要限速酶,它作用于低分子量激肽原生成賴氨酰緩激肽(kallidin)即激肽,激肽與其受體結(jié)合后,通過一系列機(jī)制可以抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖、基質(zhì)增生.該實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)利用基因重組技術(shù)制備出人組織激肽釋放酶.(2)觀察糖尿病大鼠在糖尿病的不同階段體內(nèi)激肽系統(tǒng)的活性.(3)將制備出的純品激肽釋放酶注入糖尿病大鼠體內(nèi),觀察大鼠腎臟功能和形態(tài)的變化,以探討基因

3、重組人組織激肽釋放酶對糖尿病腎病大鼠影響.方法:(1)利用基因重組(genetic recombination)制備人組織激肽釋放酶.將人組織激肽釋放酶基因片段導(dǎo)入分子桿狀病毒體內(nèi),構(gòu)建pAd.CMV-cHK質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增,然后再轉(zhuǎn)染給Hi-5昆蟲細(xì)胞,進(jìn)行目標(biāo)蛋白表達(dá),ELISA方法測定人組織激肽釋放酶的表達(dá)量.將制備出的激肽釋放酶利用離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)

4、、凝膠過濾色譜法(gel-filtration chromatography,GFC)、親和色譜(affinity chromatography,AFC)進(jìn)行分離,純化.純化后人組織激肽釋放酶用SDS-PAGE進(jìn)行純度測定.(2)將健康雄性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)制成糖尿病模型.設(shè)正常對照組(NC)、糖尿病對照組(DM)、人組織激肽釋放酶治療組(DK).自成模后開始,分別于

5、第8周,12周,16周留取尿標(biāo)本.16周后應(yīng)用硝酸酶還原法、放射免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化技術(shù)及數(shù)字化影像處理等方法,觀察各組大鼠血漿KLK變化,腎組織NO、Camp、ET-1變化,腎組織形態(tài)改變.結(jié)論:1.利用基因重組技術(shù),可以通過真核昆蟲細(xì)胞表達(dá)人組織激肽釋放酶.2.通過尾靜脈注射STZ制備糖尿病模型,8周后大鼠處于早期DN,出現(xiàn)蛋白尿.3.糖尿病大鼠體內(nèi)激肽釋放酶活性顯著降低.4.給予外源性人組織激肽釋放酶