結(jié)核桿菌ESAT-6重組核酸疫苗的制備及其免疫效果的初步研究.pdf

1、結(jié)核病是一種古老的傳染性疾病，20世紀(jì)90年代中期以來，隨著流動人口的劇增、結(jié)核菌/艾滋病毒雙重感染和耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)又重新流行。根據(jù)WHO最新報告，目前全球超過1/3的人口感染結(jié)核桿菌(約20億)，其中約10％的人口將發(fā)展為活動性結(jié)核，在HIV感染患者中發(fā)病率則更高。結(jié)核病已與艾滋病、血吸蟲感染并列為世界三大傳染性疾病。我國是全球22個結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，也是耐藥結(jié)核菌疫情嚴(yán)重的國家之一，疫情形勢嚴(yán)峻，防治任務(wù)艱巨

2、?？ń槊缱鳛槟壳拔ㄒ坏念A(yù)防結(jié)核桿菌感染的疫苗其保護(hù)效率僅在0％～85％之間。因此，發(fā)展新型抗結(jié)核病疫苗已成為醫(yī)學(xué)界急待解決的一項重要問題。 結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌。機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的提高在抗結(jié)核菌感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，如何提高結(jié)核桿菌疫苗的免疫效果，尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用是研究抗結(jié)核桿菌感染疫苗的關(guān)鍵所在。本研究基于上述考慮，開展了下列研究工作： 第一部分結(jié)核桿菌ESAT-6抗原及Flt3配體(FL)

3、雙表達(dá)核酸疫苗的構(gòu)建與體外表達(dá)目的：構(gòu)建可同時表達(dá)結(jié)核桿菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)和Flt3配體(flt3-ligand，F(xiàn)L)的重組pIRES質(zhì)粒，并在大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)中表達(dá)，為進(jìn)一步研究結(jié)核桿菌DNA疫苗奠定實驗基礎(chǔ)。方法：采用PCR的方法，分別擴(kuò)增出結(jié)核桿菌ESAT-6全長和人FL的胞外段基因。分別將這兩部分基因定向克隆入真核雙表達(dá)載體pIRES。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至GMC中，Western blot鑒定其能否

4、在GMC中表達(dá)。結(jié)果：核酸序列測定證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，該重組質(zhì)粒在體外GMC中能表達(dá)ESAT-6和FL兩種蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核桿菌ESAT-6和FL雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒，并在體外實現(xiàn)了兩者的共表達(dá)。 第二部分結(jié)核桿菌ESAT-6和Flt3配體重組DNA疫苗誘導(dǎo)C57BL/6小鼠免疫應(yīng)答的初步研究目的：研究結(jié)核桿菌ESAT-6及FL共表達(dá)質(zhì)粒對小鼠的免疫功能的影響。方法：將重組質(zhì)粒免疫小鼠，檢測小鼠體內(nèi)特異性淋巴細(xì)胞增殖、