妊娠期子宮NK細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、 目的: 胎兒是同種異基因產(chǎn)物,它攜帶被母體認(rèn)為是外源的父系MHC分子,但卻能抵御母體免疫細(xì)胞的攻擊并在妊娠中存活,這其中的機(jī)制至今仍不十分清楚。八十年代末,Starkey和King發(fā)現(xiàn)妊娠子宮中有大量CD56brightNK細(xì)胞,其特殊的分布狀態(tài)和功能使人們認(rèn)識(shí)到子宮NK細(xì)胞可能參與了胚胎的植入和母胎界面免疫平衡的維持。盡管目前對(duì)這個(gè)過程中的許多環(huán)節(jié)尚不清楚,但已初步證實(shí),子宮NK細(xì)胞(uNK細(xì)胞)的數(shù)量或功能失調(diào)與病

2、理性妊娠(如流產(chǎn)和先兆子癇等)密切相關(guān)。研究uNK細(xì)胞在妊娠中的分布與機(jī)能,探討妊娠期外周血NK細(xì)胞(pNK細(xì)胞)和uNK細(xì)胞生物學(xué)特性的差異,揭示uNK細(xì)胞在子宮微環(huán)境中的生理功能及其對(duì)母胎界面免疫平衡網(wǎng)絡(luò)的影響,有利于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)妊娠這一生理過程,并為臨床最終治療病理性妊娠提供了新的思路。 本實(shí)驗(yàn)以妊娠早期pNK細(xì)胞、uNK細(xì)胞、蛻膜組織與滋養(yǎng)層組織作為主要的研究對(duì)象,達(dá)到以下研究目的: 1.研究妊娠子宮微環(huán)境中u

3、NK細(xì)胞表面NKG2A和NKG2D及其相應(yīng)配體的表達(dá),探討NKG2A與NKG2D的不平衡表達(dá)在母胎界面免疫耐受形成中的作用。 2.研究妊娠期子宮微環(huán)境中子宮NK細(xì)胞的生物學(xué)特性,探討uNK細(xì)胞與周圍的蛻膜組織及滋養(yǎng)層組織的生理功能及相互作用,比較妊娠子宮NK細(xì)胞與外周血NK細(xì)胞在生理學(xué)功能上的差異。 方法: 1.選擇30例孕6~9周的正常妊娠婦女,分離其新鮮蛻膜組織,除去絨毛,分離蛻膜和外周血淋巴細(xì)胞,采用流式細(xì)

4、胞儀測定NK細(xì)胞在蛻膜淋巴細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的分布及其表面NKG2A與NKG2D的表達(dá),比較30例早孕婦女與30例未孕婦女外周血NK細(xì)胞表面NKG2A與NKG2D表達(dá)的差異;RT-PCR技術(shù)檢測早孕婦女滋養(yǎng)層組織中HLA-EmRNA和MICAmRNA的表達(dá)。 2.無菌取早孕婦女新鮮蛻膜組織及外周血標(biāo)本,除去蛻膜組織中的絨毛,分離蛻膜淋巴細(xì)胞,同時(shí)分離外周血淋巴細(xì)胞,免疫磁珠技術(shù)純化uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測其純度,

5、MTT法檢測uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷,效靶比分別為5:1,2.5:1,1.25:1,0.625:1。MTT法檢測uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞在4h,24h,48h,72h和96h的增殖情況。RT-PCR技術(shù)檢測uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞趨化、侵襲、促血管形成等生物學(xué)活性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)檢測其相應(yīng)配體在蛻膜組織和滋養(yǎng)層組織的表達(dá)狀況。 結(jié)果: 1.妊娠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞約占70%,流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示

6、,uNK細(xì)胞NKG2A的表達(dá)水平顯著高于pNK細(xì)胞,分別為97.86%±1.75%與33.35%±10.92%(x-±s),二者差異有顯著性(P<0.05),在滋養(yǎng)層細(xì)胞中檢測到其配體HLA-E的表達(dá);而與pNK細(xì)胞相比,uNK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)與之較為相近,分別為93.21%±4.52%與97.80%±1.72%,但二者仍有顯著性差異(P<0.05),在滋養(yǎng)層組織未檢測到其相應(yīng)配體MICAmRNA的表達(dá)。未孕婦女pNK細(xì)胞表面N

7、KG2A和NKG2D的表達(dá)分別為33.50%±8.45%與98.60%±1.18%,與早孕婦女相比無顯著性差異(P<0.05)。 2. 經(jīng)CD56免疫磁珠處理后所獲得的uNK細(xì)胞(CD56brightCD3-)與pNK細(xì)胞(CD56dimCD3-)純度)95%。 2.1 MTT法檢測uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性,發(fā)現(xiàn)在效靶比為5:1,2.5:1,1.25:1,0.625:1的條件下,uNK細(xì)胞的殺傷活性

8、遠(yuǎn)低于pNK細(xì)胞。 2.2 MTT法檢測uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞在4h,24h,48h,72h和96h的增殖情況,發(fā)現(xiàn)uNK細(xì)胞的增殖活性略高于pNK細(xì)胞。 2.3 uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞均表達(dá)趨化因子受體CCR1,CCR5,CCR7,CXCR2,CXCR4和CX3CR1mRNA,且表達(dá)強(qiáng)度相近,其中CXCR4和CX3CR1mRNA的表達(dá)水平較高。 2.4 uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞均檢測到VEGF-A、VEGF-B、

9、VEGF-C和VEGF-EmRNA的表達(dá),uNK細(xì)胞還表達(dá)PIGF和Ang2mRNA,同時(shí)蛻膜組織可表達(dá)VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3,Tie-1和Tie-2mRNA,但在滋養(yǎng)層組織中僅檢測出VEGFR2和Tie-2mRNA的表達(dá)。 2.5 一些與血管形成相關(guān)的因子如homeoboxb3,COX-2,HIFα1,TGFβ1和TGFβ3mRNA也在uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞表達(dá),iNOsmRNA僅在uNK細(xì)胞中檢出。2.6u

10、NK細(xì)胞還檢測到TIMP-1,TIMP-2和TIMP-3mRNA的表達(dá)。此外,發(fā)現(xiàn)uNK細(xì)胞中還表達(dá)OPN,perforin,granzyme,TNFα和FasLigandmRNA。 結(jié)論 1.蛻膜中的淋巴細(xì)胞主要為NK細(xì)胞,其免疫學(xué)表型與pNK細(xì)胞有較大的區(qū)別,妊娠期uNK細(xì)胞表面高表達(dá)抑制性受體NKG2A,同時(shí)滋養(yǎng)層組織表達(dá)相應(yīng)的配體HLA-E,這可能是維持母胎界面免疫耐受的重要因素。早孕婦女pNK細(xì)胞NKG2A和N

11、KG2D的表達(dá)水平與未妊娠者相似,可見妊娠期pNK細(xì)胞NKG2A和NKG2D的表達(dá)較未妊娠時(shí)并無明顯變化。此外,uNK細(xì)胞NKG2A的表達(dá)水平較pNK細(xì)胞顯著升高,NKG2D的表達(dá)水平與之較為接近,提示uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞可能源于相同的前體細(xì)胞,由于二者的發(fā)育分化環(huán)境不同導(dǎo)致了表型和功能的差異。 2.妊娠期uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞的表型、增殖和殺傷活性有較大不同,其某些細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)狀況與妊娠早期uNK細(xì)胞在蛻膜中的募集

12、和生理學(xué)功能有關(guān)。妊娠期外周血NK細(xì)胞在生理功能上與uNK細(xì)胞有較大相似性,它能產(chǎn)生多種生物活性因子,參予正常妊娠的維持,但與pNK細(xì)胞相比,uNK細(xì)胞有更強(qiáng)的促血管形成能力,因此被認(rèn)為在母胎界面的血管重建中發(fā)揮重要功能。由此可見,uNK細(xì)胞是一群具有較強(qiáng)調(diào)節(jié)功能的NK細(xì)胞亞群,它通過表面受體(或配體)與蛻膜組織或滋養(yǎng)層組織表達(dá)的配體(或受體)相互作用,直接或通過分泌一系列細(xì)胞因子調(diào)控母胎界面的血管重建及胎盤與滋養(yǎng)層組織的生長和發(fā)育,并

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