microRNA在砷致胚胎發(fā)育毒性中的作用機(jī)制研究.pdf

1、人群流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明,長(zhǎng)期暴露在含砷高的環(huán)境中,能導(dǎo)致生殖和胚胎發(fā)育異常,引起神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等出生缺陷。本研究以雞胚為動(dòng)物模型進(jìn)一步探討重金屬元素砷對(duì)胚胎發(fā)育影響的分子作用機(jī)制。我們首先應(yīng)用基因芯片篩選胚胎早期發(fā)育無(wú)機(jī)砷暴露組與正常對(duì)照組胚胎的差異mRNA和miRNA的表達(dá)譜,通過(guò)生物信息學(xué)分析差異microRNA與差異基因,構(gòu)建microRNA與差異基因功能間的相互作用網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果提示Nrp1、stmn1、HDAC4、Nrc

2、am等基因在microRNA介導(dǎo)的砷干擾胚胎發(fā)育中都發(fā)揮了重要作用,且其表達(dá)水平與相應(yīng)的microRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示Nrp1基因位于mRNA和miRNA網(wǎng)絡(luò)圖的中心位置,可能是mir-181b和mir-9的一個(gè)作用靶點(diǎn)。神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)屬跨膜糖蛋白,作為軸突導(dǎo)向分子的受體,參與神經(jīng)導(dǎo)向的調(diào)節(jié),同時(shí)作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)的共受體表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管新

3、生的調(diào)節(jié)。
　　 鑒于Nrp1基因在血管生成方面發(fā)揮著重要的作用,我們以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926為細(xì)胞模型,研究mir-181b、mir-9調(diào)控Nrp1表達(dá)在無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的血管增生中的作用,研究結(jié)果提示EA.hy926細(xì)胞系暴露于無(wú)機(jī)砷環(huán)境下mir-181b、mir-9表達(dá)降低,Nrp1的表達(dá)增加,且呈劑量時(shí)間依賴關(guān)系。為了探討mir-181b、mir-9與Nrp1的調(diào)控關(guān)系,我們?cè)贓A.hy926細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)和敲低mir

4、-181b和mir-9,研究表明過(guò)表達(dá)mir-181b和mir-9可以明顯降低Nrp1蛋白水平,敲低mir-181b和mir-9表達(dá)可以增加Nrp1蛋白的表達(dá),結(jié)果提示mir-181b和mir-9可能作用于Nrp1的3’-UTR序列,調(diào)節(jié)其表達(dá)。為了進(jìn)一步證明Nrp1的3’UTR.序列包含mir-181b和mir-9作用的位點(diǎn),我們將Nrp1的3’-UTR序列克隆至螢光報(bào)告載體中,并與mir-181b和mir-9的模擬物與抑制物共轉(zhuǎn)染至

5、EA.hy926細(xì)胞中,然后檢測(cè)螢光素酶的活性,結(jié)果表明mir-181b和mir-9的過(guò)表達(dá)可以明顯抑制螢光素酶的活性；與之相反,當(dāng)我們將包含Nrp1的3’-UTR序列的螢光素酶報(bào)告載體中mir-181b和mir-9可能的結(jié)合位點(diǎn)剪切或突變以后,再和mir-181b和mir-9的模擬物與抑制物共轉(zhuǎn)染至EA.hy926細(xì)胞中,螢光素酶的活性僅發(fā)生微弱的變化,這說(shuō)明mir-181b和mir-9可以直接作用于Nrp1的3’UTR區(qū)調(diào)控其表達(dá)。

6、
　　 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行гu(píng)估測(cè)定離體血管生成,我們通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和血管生成實(shí)驗(yàn)證明無(wú)機(jī)砷通過(guò)miRNA介導(dǎo)的Nrp1表達(dá)上升促進(jìn)血管生成。結(jié)果提示細(xì)胞暴露在砷環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)和小管生成數(shù)增加,與對(duì)照組比較,有顯著性差異。而轉(zhuǎn)染mir-181b和mir-9模擬物后過(guò)表達(dá)mir-181b和mir-9的細(xì)胞在暴露于砷環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)和小管生成數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,提示過(guò)表達(dá)mir-181b和mir