云南紅豆杉內(nèi)生真菌的固定化及其GGPP酶的研究.pdf

1、篩選和應(yīng)用紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇己成為當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點之一。GGPP合成酶是紫杉醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化合成紫杉烷類化合物的共同前體--牻牛兒牻牛兒焦磷酸酯(簡稱GGPP)。利用固定化技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，由于固定化酶具有可長期重復(fù)使用，連續(xù)發(fā)酵和簡化代謝產(chǎn)物分離過程等優(yōu)點，是一種很有發(fā)展前景的新型技術(shù)。因此，本文以產(chǎn)紫杉烷類化合物的云南紅豆杉內(nèi)生真菌菌株12.3.2作為研究對象，對其生理特性、固定化條件和GGPP

2、合成酶活性進行了一系列初步研究。 首先，考察了培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件對其生理特性的影響，研究發(fā)現(xiàn)：溫度對菌絲體生長具有明顯的影響，最適溫度為30℃；pH值在前24小時呈下降趨勢，然后開始逐步升高，在5天后趨于穩(wěn)定，綜合pH的變化，菌株在中性條件時生長良好，在接種后3天菌絲體干質(zhì)量可達到最大值；蔗糖對菌絲體的生長最為有利，對有機氮的利用要優(yōu)于對無機氮的利用；菌絲體干質(zhì)量與培養(yǎng)基質(zhì)量濃度呈正向關(guān)系，而且較高的培養(yǎng)基質(zhì)量濃度對其生長沒有抑制

3、作用；對維生素依賴性不強，但添加適量的維生素可以促進其生長。 其次，建立TTC法測定紅豆杉內(nèi)生真菌分生孢子的脫氫酶酶活，并以此來考察固定化效果。用海藻酸鈣包埋云南紅豆杉內(nèi)生真菌12.3.2分生孢子制成固定化孢子的微膠珠。通過TTC法測定紅豆杉內(nèi)生真菌分生孢子的脫氫酶活力，并以此來考察固定化粒徑、海藻酸鈉的濃度、CaCl2濃度、單位凝膠分生孢子量、固定化時間以及溫度等六個因素對固定化效果的影響。通過實驗確定，當(dāng)海藻酸鈉濃度為4.0

4、％，CaCl2濃度為2.6％，固定化時間為6h，溫度為40℃，單位凝膠中分生孢子量應(yīng)為1mL/10g凝膠(孢子懸液濃度為2.3×109個/mL)，此條件下包埋率為46％，此時內(nèi)生真菌12.3.2活力最強，固定化效果最佳。因此，TTC法可以準(zhǔn)確反應(yīng)紅豆杉內(nèi)生真菌分生孢子的固定化效果，固定的分生孢子具有更好的發(fā)酵特性。 最后，初步探討了GGPP合成酶活性的檢測。該酶屬于異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，催化FPP與IPP發(fā)生親電子耦合形成GGPP。對