馬錢子—蘇木與馬錢子—白術配伍減毒增效及治療痹證機理的研究.pdf

1、目的:在中醫(yī)藥理論指導下,以臨床應用為依據(jù),對古今醫(yī)家應用馬錢子配伍減毒增效的相關文獻進行系統(tǒng)梳理,通過對馬錢子-蘇木、馬錢子-白術(以下簡稱馬蘇、馬術)不同配比毒性、鎮(zhèn)痛、抗炎作用的實驗研究,觀察配伍后的減毒增效作用,尋求最佳配比,并分別從抗自由基損傷、細胞因子和細胞凋亡三方面,探求其鎮(zhèn)痛、抗炎免疫和細胞凋亡的機理;從氣味配伍理論方面,闡釋馬蘇、馬術配伍后減毒增效的理論意義及治療痹證的配伍意義,為臨床應用馬錢子治療RA提供科學依據(jù)。方

2、法:1.采用高效液相色譜法(HPLC),測定馬蘇、馬術不同配比煎劑在配伍后馬錢子堿和士的寧含量的變化;通過急性毒性實驗,觀察小鼠死亡狀態(tài)、記錄死亡數(shù)量,采用Bliss法計算半數(shù)致死量(LD50),分析不同配比毒性強弱的變化,并尋求減毒最佳配比。2.通過小鼠熱板法和扭體法,分別測定給藥后小鼠舔足潛伏期和15min內扭體總數(shù),并計算不同配比煎劑對扭體反應的抑制率,觀察對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響,尋求鎮(zhèn)痛最佳配比。3.建立佐劑關節(jié)炎大鼠模型,用千分

3、尺測定大鼠足跖腫脹程度;計算免疫器官系數(shù);測定佐劑關節(jié)炎(AA)大鼠血清中NO、SOD、MDA含量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測定AA大鼠血清中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、CRP、CIC、滑膜中PGE2、Cor的含量變化;采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR),觀察滑膜組織IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA的表達,探討不同配比鎮(zhèn)痛和免疫的機理,尋求最佳配比;采用Elisa法測定AA大鼠滑膜中Fas、B

4、cl-2的含量,通過免疫組化法(IHC)觀察滑膜中Fas的表達情況,初步觀察不同配比抗細胞凋亡的機理。4.采用HE染色,觀察大鼠肝、腎、腦組織病理變化,對比分析不同配比對各組織的長期毒性影響;觀察滑膜組織病理變化,分析給藥后抗炎療效。結果:1.通過HPLC測定,與馬錢子單煎劑比較,馬蘇1:2、1:4、1:6煎劑馬錢子堿含量分別降低68.8％、76.8%、99.3%,士的寧含量分別降低56.8%、66.9%、93.6%;馬術1:2、1:4

5、、1:6煎劑中馬錢子堿分別升高17.6%,降低23.5%、29.0%,士的寧含量分別升高60.7%、降低8.51%、16.6%。2.馬蘇、馬術對小鼠急性毒性的影響通過計算馬錢子單煎劑、馬蘇1:2、1:4、1:6和馬術1:2、1:4、1:6煎劑組的LD50分別為605.92、827.21、1084.7、1479.4、401.64、664.1、953.79mg/kg。3.馬蘇、馬術對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響熱板法:馬蘇1:4、1:6和馬術1:6煎

6、劑組在給藥后能提高小鼠痛閾值,延長疼痛反應時間(P＜0.01或P＜0.05),其中以馬蘇、馬術1:6煎劑組效果較好。扭體法:馬術1:6煎劑組對小鼠扭體次數(shù)的抑制作用明顯強于馬錢子單煎劑組(P＜0.05),扭體抑制率為26.75%,效果較佳,其余各組無明顯變化。4.馬蘇、馬術對AA大鼠抗炎作用的影響原發(fā)性足跖腫脹:在治療過程中馬錢子單煎劑、馬蘇1:4、1:6和馬術1:6煎劑組能明顯減輕大鼠足跖腫脹程度,抗炎效果較為明顯(P＜0.01或P＜

7、0.05)。繼發(fā)性足跖腫脹:各配伍組給藥后足跖腫脹明顯減輕,馬蘇1:4、1:6和馬術1:6煎劑組抗炎效果較為突出(P＜0.01或P＜0.05),較佳配比為馬蘇1:6、馬術1:6。5.馬蘇、馬術對AA大鼠免疫器官系數(shù)的影響馬錢子單煎劑組、馬蘇1:4、1:6和馬術1:2、1:4、1:6煎劑組可使胸腺系數(shù)減小(P＜0.01或P＜0.05)。馬錢子單煎劑組、馬蘇1:2、1:4和馬術1:6煎劑組大鼠脾系數(shù)明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。6

8、.馬蘇、馬術對AA大鼠血清NO、SOD、MDA的影響馬蘇1:6煎劑組能降低大鼠血清中NO含量(P＜0.05);馬錢子單煎劑組、馬蘇1:2、1:4、1:6和馬術1:2、1:4、1:6煎劑組可提高SOD的含量(P＜0.05或P＜0.01);馬蘇1:4、1:6和馬術1:2、1:4、1:6煎劑組能明顯降低MDA含量(P＜0.01)。7.馬蘇、馬術對AA大鼠細胞因子的影響給藥后,馬蘇1:2煎劑組中IL-1β、CRP的含量有所降低(P＜0.01或P

9、＜0.05),馬蘇1:4煎劑組中IL-1β、TNF-α、CRP含量降低明顯(P＜0.01或P＜0.05),馬蘇1:6煎劑組中IL-1β、TNF-α、IL-6、CIC、CRP含量降低明顯(P＜0.01或P＜0.05);給藥后,馬術1:2煎劑組中IL-6、IL-10、CRP的含量有所降低(P＜0.01或P＜0.05),馬術1:4煎劑組中IL-1β、IL-6、IL-10、CRP、CIC、 Cor含量降低明顯;馬術1:6煎劑組中IL-1β、TN

10、F-α、IL-6、IL-10、CRP、CIC、Cor含量降低明顯(P＜0.01或P＜0.05)。8.馬蘇、馬術對AA大鼠滑膜組織細胞因子mRNA表達的影響馬錢子單煎劑組、馬蘇1:2、1:4、1:6煎劑組的IL-1β mRNA表達水平明顯下調(P＜0.05或P＜0.01)。馬蘇1:6煎劑組IL-10mRNA表達較模型組明顯上調(P＜0.05)。各組對TNF-α mRNA的表達均無明顯影響。9.馬蘇、馬術對AA大鼠細胞凋亡因子Fas、Bcl

11、-2的影響馬錢子單煎劑組、馬蘇1:6煎劑組能顯著降低大鼠滑膜組織中Fas的含量(P＜0.01);同時,IHC顯示馬蘇1:6煎劑組較模型組Fas的陽性表達減少,定位于胞漿內。馬蘇1:6煎劑組能明顯提高滑膜組織中Bcl-2的含量(P＜0.05)。10.馬蘇、馬術對AA大鼠肝、腎、腦和滑膜組織病理形態(tài)學的影響配伍組能顯著改善對肝臟炎細胞浸潤、纖維組織增生,減少腎臟腎小球萎縮和系膜增生、改善腎小管管腔狹窄和管腔蛋白;改善腦組織皮層水腫和神經元固

12、縮。減輕滑膜組織增厚、炎細胞浸潤、纖維組織增生和壞死,以馬蘇、馬術1:6煎劑組效果最明顯。結論:馬蘇、馬術配伍后可降低馬錢子毒性,增強馬錢子鎮(zhèn)痛和抗炎作用,適宜的配比具有減毒增效作用。馬蘇抗炎免疫的機理為降低NO、MDA、IL-1β、IL-1βmRNA和TNF-α,減少IL-6的分泌,使CIC和CRP含量降低,降低促凋亡因子Fas并升高SOD和抑制凋亡因子Bcl-2含量,上調IL-10mRNA的表達;馬術抗炎免疫的機理為通過降低MDA、