基于RNA測(cè)序技術(shù)的人NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株數(shù)字基因表達(dá)譜分析.pdf

1、背景:
　　NK細(xì)胞淋巴瘤(NKCL)屬于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一種特殊亞型，約占NHL的2％～10％，WHO最新分類(lèi)將其分為兩種亞型:結(jié)外NK細(xì)胞淋巴瘤，鼻型(extranodal NK/T-cell lymphoma，nasal type，ENKL)和進(jìn)展期NK細(xì)胞白血病/淋巴瘤(aggressive NK-cell leukemia,ANKL)，這類(lèi)疾病大都發(fā)生于亞洲和拉丁美洲人群，其惡性細(xì)胞大多來(lái)源于成熟的NK細(xì)胞(C

2、D2+，CD56+，胞質(zhì)CD3ε+以及EBV+)，少部分來(lái)源于NK樣細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD56+，EBV+);NK細(xì)胞淋巴瘤的大部分腫瘤細(xì)胞上可以檢測(cè)到EB病毒(EBV)的存在，提示EBV在此類(lèi)淋巴瘤的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要作用;在組織學(xué)上以血管破壞、腫瘤壞死與凋亡為其特征表現(xiàn)，因此是一類(lèi)高度侵襲性疾病。根據(jù)病變部位的不同，ENKL可以分為兩種主要亞型:鼻腔和鼻以外部位，前者稱(chēng)為鼻腔NK細(xì)胞淋巴瘤，后者為鼻型NK細(xì)胞淋巴瘤。晚期患者的臨床過(guò)

3、程進(jìn)展比較快，尤其是鼻型NK細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后差，與ANKL相似。眾所周知，多藥耐藥(MDR1)基因編碼產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)高表達(dá)于ENKL和ANKL腫瘤細(xì)胞，故NK細(xì)胞淋巴瘤對(duì)于傳統(tǒng)的含蒽環(huán)類(lèi)化療藥物化療方案的療效比較差，故NKCL是一種高度侵襲性、對(duì)傳統(tǒng)化療方案耐藥且預(yù)后較差的惡性疾病。但是由于NKCL發(fā)病率比較低，而且有地域上的明顯差異，所以其病因及發(fā)病機(jī)制的研究至今尚無(wú)定論。
　　近年來(lái)，RNA測(cè)序技術(shù)[1，2]在腫瘤基

4、因表達(dá)譜的研究上發(fā)揮了重要作用，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了腫瘤診斷技術(shù)和治療手段的發(fā)展。通過(guò)對(duì)某一種癌癥的腫瘤組織和正常對(duì)照組織進(jìn)行外顯子測(cè)序，有關(guān)研究已經(jīng)找到了與卵巢癌、腎癌、胰腺癌、膀胱移行細(xì)胞癌及白血病等的發(fā)病有關(guān)的基因突變[3-7];還有應(yīng)用測(cè)序技術(shù)從腫瘤患者血漿中檢測(cè)腫瘤特異性重排基因來(lái)作為生物標(biāo)記物來(lái)提高腫瘤個(gè)體化診斷的水平;還可以通過(guò)這種生物學(xué)標(biāo)記物來(lái)監(jiān)測(cè)治療后殘余病變。其中數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gen

5、e expression，DGE)是從轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量的一種高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)對(duì)不同樣本進(jìn)行DGE檢測(cè)，可以找出差異表達(dá)基因，同時(shí)可以對(duì)差異基因進(jìn)行分析，從而找出有意義的差異表達(dá)基因。DGE被廣泛用于各個(gè)行業(yè)的基礎(chǔ)研究，尤其是腫瘤學(xué)，可是在NK細(xì)胞淋巴瘤方面卻沒(méi)有相關(guān)研究。
　　目的:
　　通過(guò)對(duì)正常人NK細(xì)胞和兩株NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(YTS和SNK-6)進(jìn)行DGE檢測(cè)，構(gòu)建出1個(gè)正常NK細(xì)胞兩個(gè)N

6、K/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的DGE文庫(kù)，并篩選出三個(gè)細(xì)胞系之間的差異表達(dá)基因，明確NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中常見(jiàn)耐藥相關(guān)基因的差異表達(dá)情況;利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(quantitative Real-time PCR，qPCR)擴(kuò)增兩個(gè)耐藥相關(guān)基因在三個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)，來(lái)驗(yàn)證測(cè)序分析的準(zhǔn)確性，為探討NK/T細(xì)胞淋巴瘤的病因和耐藥機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　采用DGE檢測(cè)正常人NK細(xì)胞和YTS、SNK-6的數(shù)字基因表達(dá)

7、譜及差異基因表達(dá);采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Real-timePCR，qRT-PCR)檢測(cè)常見(jiàn)的兩個(gè)耐藥相關(guān)基因ABCC5和ERBB4的表達(dá)水平，以驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、構(gòu)建了一個(gè)正常NK細(xì)胞和兩個(gè)NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression，DGE)文庫(kù)，篩選出了三個(gè)細(xì)胞系之間的明顯差異表達(dá)基因。
　　2、Real-time PCR檢測(cè)DGE中顯著差異表達(dá)的