重組人單核細(xì)胞趨化蛋白-1對(duì)荷骨肉瘤裸鼠的抑瘤效應(yīng)及其與高劑量氨甲喋呤的協(xié)同作用.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文重組人單核細(xì)胞趨化蛋白1對(duì)荷骨肉瘤裸鼠的抑瘤效應(yīng)及其與高劑量氨甲喋呤的協(xié)同作用姓名：陳宗雄申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)（骨外）指導(dǎo)教師：賈連順包聚良2002.3.1笙三星墮盔堂整主堂垡堡壅一t組人單核細(xì)胞趨化蛋白1對(duì)荷骨肉瘤裸鼠的抑瘤效應(yīng)及其與HDMTX的協(xié)同作用摘要【目的】觀察重組人單核細(xì)胞趨化蛋白一I(MCP一1)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞種植和骨肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其與HDMTX對(duì)荷骨肉瘤裸鼠的協(xié)同治療作用。為l臨床進(jìn)

2、一步應(yīng)用重組人MCP1抗瘤作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。f＼【方法】應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)等技術(shù)，(1)將pGEXIN／MCP一1＼質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TG一1大腸桿菌中，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA應(yīng)用EcoRHI酶、BaraHI酶進(jìn)行雙酶切鑒定。(2)應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組人MCP1蛋白，提取、純化人MCP—l融合蛋白，SDS—PAGE電泳法及WesternBlot法鑒定融合蛋白，光密度法測(cè)定濃度、純度。(3)擴(kuò)增培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞HOS一8

3、603，接種于裸鼠皮下，建立骨肉瘤動(dòng)物模型。(4)將50只裸鼠分為lO組：其中A。組在接種骨肉瘤細(xì)胞同時(shí)注射MCP—l，劑量分別為1ug、10ug、100ug、lmg；B。～組在骨肉瘤細(xì)胞接種2周形成瘤體后予局部隔日注射MCP一1，劑量分別為0ug(02mlNS)、1ug、10ug、10011g、lmg，共20天；C組作空白對(duì)照。觀察裸鼠臨床及病理學(xué)指標(biāo)。(5)在骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度MTX繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化，提取

4、等數(shù)細(xì)胞RNA，進(jìn)行電泳分析。(6)將裸鼠25只隨機(jī)分為5組：荷瘤化療組、荷瘤免疫治療組、荷瘤對(duì)照組、荷瘤聯(lián)合治療組、正常裸鼠組空白對(duì)照。觀察裸鼠臨床及病理學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo)。【結(jié)果】(1)pGEXIN／MCP。1質(zhì)粒雙酶切后獲得一240bpDNA片段：(2)融合表達(dá)產(chǎn)物蛋白分子量為34KD，與抗MCP1的單克隆抗體呈陽(yáng)性結(jié)合；(3)A。～。組中MCP一1明顯阻止了骨肉瘤細(xì)胞的種植，^。組中極小劑量MCP—l也明顯延遲其種植生長(zhǎng)，抑瘤指數(shù)為