天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程以及對(duì)微小RNA表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　特發(fā)性肺纖維化(IPF)為原因不明并以普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)為特征性的病理改變的一種慢性纖維化性間質(zhì)性肺疾病,預(yù)后不良,無(wú)有效治療藥物,其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。肺泡上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal Transitionn,EMT)是肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié),是決定肺間質(zhì)纖維化程度的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)前期我們采用了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)開(kāi)展了天龍咳喘

2、靈提取物干預(yù)肺泡上皮EMT的研究,結(jié)果證明:天龍咳喘靈提取物不僅能有效阻止甚至能夠逆轉(zhuǎn)肺泡上皮EMT。
　　microRNA(miRNA)是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約22nt(核苷酸)的非編碼小RNA分子,其廣泛存在于真核生物體內(nèi),人類(lèi)基因有近1/3受其調(diào)控。已有研究證明,部分miRNA參與了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展,特定的miRNA有望成為肺間質(zhì)纖維化治療的新靶點(diǎn)。天龍咳喘靈是廣東省名中醫(yī)邱志楠教授的經(jīng)驗(yàn)方,成方主要由熟附子、青天葵、法半

3、夏、款冬花、五味子等十味中草藥材組成。臨床長(zhǎng)期用于治療喘息型慢性支氣管炎、肺間質(zhì)纖維化、哮喘等,療效明確且無(wú)毒副反應(yīng)。為此,我們進(jìn)一步采用miRNA芯片技術(shù),觀察天龍咳喘靈提取物抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT時(shí)miRNA表達(dá)譜的變化,為進(jìn)一步研究miRNA在肺泡上皮細(xì)胞EMT中的生物學(xué)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　第一部分:天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E

4、MT過(guò)程
　　1.采用MTT法檢測(cè)天龍咳喘靈提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響,觀察其劑量和時(shí)間的相互依賴(lài)性。
　　2.模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境,體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,天龍咳喘靈提取物和/或TGF-β1刺激A549細(xì)胞后,應(yīng)用相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　3.RT-PCR、Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化,研究天龍咳喘靈提取物對(duì)TGF-β1

5、誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的影響。
　　第二部分:miRNA在天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT時(shí)的表達(dá)變化
　　1.體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,天龍咳喘靈提取物和/或TGF-β1刺激A549細(xì)胞后,提取其總RNA,檢測(cè)RNA的純度和完整性。
　　2.應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT過(guò)程miRNA表達(dá)的變化。
　　3.應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(

6、RT-PCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果:
　　第一部分:天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT過(guò)程
　　1.復(fù)方天龍咳喘靈提取物濃度在50μg/ml以上時(shí),24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。
　　2.TGF-β1與A549共培養(yǎng)48h后顯微鏡下觀察,可見(jiàn)與對(duì)照組A549細(xì)胞比較,經(jīng)TGF-β15ng/ml刺激后,大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出梭狀成纖維細(xì)胞形態(tài),而在同時(shí)

7、添加天龍咳喘靈提取物50μg/ml的A549細(xì)胞,上述梭狀成纖維形態(tài)細(xì)胞較前明顯較少,形態(tài)改變呈逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)。
　　3.RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示TGF-β15ng/ml可以誘導(dǎo)EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白α-SMA表達(dá)的明顯上調(diào),而加入天龍咳喘靈提取物50μg/ml時(shí)可以明顯抑制這種表達(dá)的上調(diào)。
　　第二部分:微小RNA(miRNA)在天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT時(shí)的表達(dá)變化
　　1

8、.核酸檢測(cè)儀檢測(cè)3組樣本總RNA的OD260/OD280值均在1.8-2.0之間,瓊脂糖凝膠電泳可觀察到18S與28SrRNA兩條清晰條帶,且亮度之比接近1:2。
　　2.芯片掃描獲得誘導(dǎo)前后miRNA差異表達(dá)譜,采用custom error model(美國(guó)Illumina產(chǎn)品)進(jìn)行差異基因分析,篩選出210個(gè)detection p-value≦0.05miRNA。分析樣本間miRNA表達(dá)量的變化,識(shí)別出組間差異表達(dá)miRNA,

9、提取數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,篩選出2倍以上差異表達(dá)的miRNA共81個(gè),其中與空白對(duì)照組比較,TGF-β1組有41種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)顯著改變,其中26種表達(dá)上調(diào)2倍以上,15種表達(dá)下調(diào)2倍以上;天龍咳喘靈提取物抑制組,有46種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化,其中25種表達(dá)上調(diào)2倍以上,21種表達(dá)下調(diào)2倍以上;并且有17種miRNA表達(dá)在兩組同時(shí)出現(xiàn)顯著改變,其中在TGF-β1組明顯上調(diào)而在天龍咳喘靈提取物抑制組明顯下調(diào)13種,在TGF-β

10、1組明顯下調(diào)而在天龍咳喘靈提取物抑制組明顯上調(diào)4種。其中包括mir-29a-3p、mir-29b-3p等在TGF-β1組下調(diào)而在天龍組上調(diào);mir-139-3p在TGF-β1組上調(diào)而在天龍組下調(diào)。
　　3.為驗(yàn)證芯片表達(dá)譜結(jié)果的準(zhǔn)確性,挑選miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-139-3p做熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果為,和空白對(duì)照組比較:mir-29a-3p在TGF-β1組下調(diào)47.67％、天龍組上調(diào)79.1

11、9%;mir-29b-3p在TGF-β1組下調(diào)25.86%、天龍組上調(diào)150.69%;mir-139-3p在TGF-β1組上調(diào)74.17%、天龍組下調(diào)40.01%。結(jié)果基本與芯片表達(dá)譜結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.復(fù)方天龍咳喘靈提取物能夠抑制甚至逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT,EMT是纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),提示其在抗纖維化藥物治療上的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　2、miRNA表達(dá)的上調(diào)/下調(diào)與天龍咳喘靈抑制/逆