LINE-1甲基化與肝癌臨床病理和預(yù)后關(guān)系.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC以下簡(jiǎn)稱肝癌)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是多階段(從炎癥感染、組織纖維化、慢性肝硬化至肝癌)、多致瘤因素累積的過(guò)程，盡管近年來(lái)對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的病理研究已取得很大進(jìn)展，但對(duì)其分子機(jī)制的理解仍然有限。
　　 DNA甲基化通過(guò)結(jié)合甲基化結(jié)合域(MBD)和組蛋白乙酰化能引起基因的表達(dá)沉默，而去甲基化則能激活基因的表達(dá)。在腫瘤形成中，DNA甲基化紊亂可表現(xiàn)為基

2、因組整體的低甲基化(hypomethylation)以及特定區(qū)域(如啟動(dòng)子區(qū)域)高甲基化(hypermethylation)。人類腫瘤基因組的整體低甲基化現(xiàn)象早在1983年被Feiberg等發(fā)現(xiàn)。低甲基化與基因組穩(wěn)定性密切相關(guān)，影響基因正常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞中基因組整體甲基化水平降低的表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)成為腫瘤分子病理研究的熱點(diǎn)。
　　 人類染色體中心體周圍的異染色質(zhì)緊密封裝著大量DNA重復(fù)序

3、列(LINE，SINE，IAP,和Alu片段)。為了減少轉(zhuǎn)錄“噪音”，提高轉(zhuǎn)錄效率，在正常細(xì)胞中，異染色質(zhì)處于高度甲基化的表觀遺傳學(xué)上的沉默狀態(tài)。而在腫瘤中，基因組的低甲基化往往伴隨著DNA重復(fù)序列的低甲基化。其中LINE-1序列的低甲基化現(xiàn)象已在多種腫瘤中被證實(shí)，包括結(jié)腸癌，膀胱上皮癌，惡性生殖細(xì)胞瘤，卵巢癌，宮頸癌，前列腺癌等。目前，LINE-1甲基化狀態(tài)已經(jīng)成為腫瘤基因組整體低甲基化水平的標(biāo)記物。
　　 目前關(guān)于在肝癌中研

4、究LINE-1的甲基化修飾的報(bào)道很少，在組織標(biāo)本中的研究?jī)H提示9例肝癌組織與癌旁組織中存在LINE-1甲基化頻率的差異，研究標(biāo)本的數(shù)量非常有限，與臨床病理的關(guān)系也沒(méi)有得到探討。另有在病人血清中LINE-1的甲基化研究提示肝癌病人血清中LINE-1甲基化水平低于肝硬化、肝炎病人血清中LINE-1甲基化水平，血清LINE-1甲基化水平與病人預(yù)后生存率相關(guān)。但是因?yàn)檠逯心[瘤細(xì)胞量少，不能完全體現(xiàn)腫瘤組織中LINE-1基因甲基化修飾情況。對(duì)肝

5、癌組織標(biāo)本的檢測(cè)，更能全面地反映患者LINE-1基因甲基化水平，從而觀察此基因甲基化修飾在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。本研究擬采用實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative methylation-specific PCR)技術(shù)，檢測(cè)95例HCC癌組織和相應(yīng)癌旁組織及10例正常肝組織中LINE-1序列的甲基化狀態(tài)，探討肝癌基因組整體甲基化狀態(tài)并分析其與臨床病理的關(guān)系，以期進(jìn)一步闡述肝細(xì)胞癌的表觀遺傳分子

6、機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要有以下二部分組成：
　　 一、RTQ-MSP檢測(cè)LINE-1序列甲基化的方法建立和檢測(cè)
　　 本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量MS-PCR，即在重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀對(duì)甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物(M)和非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物(U)進(jìn)行定量檢測(cè)，然后根據(jù)公式：甲基化水平=M/M+U×100％計(jì)算LINE-1的甲基化水平，可對(duì)LINE-1的甲基化水平進(jìn)行量化。我們對(duì)95例肝癌、癌旁組織及10例正常組織中

7、LINE-1序列的甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，肝癌組織中LINE-1甲基化水平為75.91％(mean)，癌旁組織中LINE-1甲基化水平為92.48％(mean)，正常肝組織中l(wèi)ine-1甲基化水平為95.30％(mean)，肝癌組織LINE-1的甲基化水平明顯低于癌旁(p＜0.001)和正常肝組織(p＜0.001)，結(jié)論：和其他腫瘤一樣，在肝癌中也存在著LINE-1低甲基化現(xiàn)象。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LINE-1低甲基化可能在肝癌發(fā)

8、生發(fā)展的過(guò)程中有非常重要的作用。
　　 二、LINE-1甲基化水平與肝癌臨床病理和預(yù)后的關(guān)系
　　 我們收集了95例病人的臨床病理資料，對(duì)病人進(jìn)行隨訪，掌握病人預(yù)后情況，對(duì)臨床病理資料與LINE-1甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；使用K-M生存曲線分析LINE-1甲基化水平高組與LINE-1甲基化水平低組肝癌患者生存期上的差別。根據(jù)肝癌組織中的LINE-1平均甲基化水平(75.91％)，我們將肝癌病例分為L(zhǎng)INE-1甲基化水平＜

9、75.91％組和LINE-1甲基化水平≥75.91％組與臨床病理資料進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINE-1甲基化水平與腫瘤有無(wú)包膜、有無(wú)血管侵犯、腫瘤大小、血清HBV DNA定量、肝癌TNM分期相關(guān)。僅一步分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑越大、血清HBV DNA定量值越高、TNM分期越靠后的病例其LINE-1甲基化水平越低。腫瘤直徑≥7cm的肝癌中LINE-1甲基化水平(65.11％)明顯低于腫瘤直徑(4＜d＜7cm)組(77.62％)(p=0.044)

10、和腫瘤直徑(≤cm)組(89.19％)(p＜0.001)。同時(shí)，血清HBV DNA定量高組(≥1×105copy/ml)的肝癌病例中的LINE-1甲基化水平(62.38％)明顯低于血清HBV DNA定量中(1×103-1×105 copy/ml)組(76.55％)(p=0.048)和血清HBV DNA定量低(＜1×103copy/ml)組(86.98％)(p＜0.001)。TNMI-Ⅱ期組病例的LINE-1甲基化水平86.87％明顯高于