乳腺癌中趨化因子XCL1-XCR1生物學(xué)軸的作用及與ERα的關(guān)系研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 在XCR1陽性乳腺癌中，ERα對XCL1的調(diào)節(jié)及作用機理
　　目的:研究雌激素受體α(Estrogen receptorα，ERα)在XCR1陽性人乳腺癌細(xì)胞系中與趨化因子XCL1的關(guān)系及其機制。
　　方法:用Kaplan Meier Plotter軟件預(yù)測C族趨化因子配基1(XCL1，Ltn)及其受體XCR1對ERα陰性(ERα-)與ERα陽性(ERα+)乳腺癌患者無病

2、生存期(DFS)的影響。采用Real-time PCR檢測9種人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468、 MDA-MB-231HM、MDA-MB-231BO、MCF-7、T47D、 BcaP-37、ZR-75-30、SK-BR-3)和1種正常乳腺上皮細(xì)胞系（MCF-10A）中XCL1及其受體XCR1的基因表達(dá)水平;通過CCK8細(xì)胞增殖實驗確定XCL1促進(jìn)細(xì)胞生長的最適濃度，并且觀察加入選擇性雌激素受體下調(diào)劑氟維司群(I

3、CI182780)后對細(xì)胞生長的影響。ELISA篩選XCL1的最適作用時間。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析共定位關(guān)系。免疫共沉淀實驗分析XCL1的ERα的直接結(jié)合關(guān)系。
　　結(jié)果:預(yù)測顯示XCL1可延長ERα-乳腺癌患者的DFS，但對ERα+乳腺癌患者的DFS無影響，而XCR1無論對ERα-還是ERα+乳腺癌患者DFS均無影響。體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明，XCL1在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231HM和ZR-75-30中高表達(dá)，在正常乳腺上皮

4、細(xì)胞及其它7種乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá);XCR1在ERα+乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、BCaP-37、ZR-75-30中高表達(dá)，而在ERα-乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468中低表達(dá)，提示XCR1的表達(dá)可能與ERα狀態(tài)相關(guān)。在乳腺癌患者手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本中，通過免疫組化方法進(jìn)一步驗證了XCR1與ERα的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)加入200 ng/ml重組人XCL1(rhXCL1)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，ICI182780能逆

5、轉(zhuǎn)此作用，其機理可能與抑制MAPK信號通路有關(guān)，表現(xiàn)為加入rhXCL1后，總蛋白ERK和MEK無明顯變化，而pERK和pMEK明顯增加，但加入ICI182780后，pERK和pMEK表達(dá)下降。此外，XCL1與ERα具有共定位關(guān)系，但未能證明直接結(jié)合關(guān)系，提示二者之間可能存在間接結(jié)合蛋白。
　　結(jié)論:在ERα陽性的人乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌患者手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本中，XCR1均呈高表達(dá)，其細(xì)胞內(nèi)定位與ERα相一致，同時在一定濃度下重組X

6、CL1在體外可活化MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并促進(jìn)ERα陽性MCF-7細(xì)胞的生長，此作用可被選擇性雌激素受體下調(diào)劑氟維司群所逆轉(zhuǎn)，提示XCL1-XCR1生物學(xué)軸與雌激素受體之間存在串話，XCL1可能是雌激素受體下游的效應(yīng)分子之一。此外，在肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系中XCL1呈高表達(dá)，表明XCL1可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　第二部分 XCR1過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移和體內(nèi)成瘤性的影響及作用機制
　　目的:研究XCR1過表達(dá)對乳腺

7、癌生長、侵襲、遷移和體內(nèi)成瘤性的影響及相關(guān)的作用機制。
　　方法:在XCR1低表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞系（以下簡稱231）中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建XCR1的過表達(dá)細(xì)胞系MDA-MB-231/XCR1(以下簡稱231/XCR1);采用CCK-8法、平板克隆實驗、Transwell侵襲及轉(zhuǎn)移實驗分析XCR1過表達(dá)后細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移及侵襲性的改變，并用免疫熒光技術(shù)和Western blot法探討其可能作用機理。取BA

8、LB/c裸小鼠每組6只，采用乳腺脂肪墊(mfp)注射法分別接種XCR1過表達(dá)及對照組細(xì)胞5×106/100μl，觀察移植瘤大小及肺轉(zhuǎn)移數(shù)目。最后通過Kaplan Meier Plotter軟件預(yù)測XCR1在ERα+乳腺癌中對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者DFS的影響。蛋白水平改變由Western blot進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:Real-time PCR及RT-PCR、Western blot結(jié)果分別在mRNA表達(dá)和蛋白水平驗證了XCR1過表達(dá)細(xì)胞

9、系的成功建立。與對照組相比，XCR1過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、克隆形成，但促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲，其差異具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義(p＜0.05)。進(jìn)一步的機制研究顯示XCR1抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)可能與降低MAPK和PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)p-P53和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的產(chǎn)生來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BALB/c裸小鼠移植瘤標(biāo)本中免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實p-P53和LC3的表達(dá)增加。同時，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的表達(dá)減

10、少，從而促進(jìn)XCR1介導(dǎo)的細(xì)胞遷移及侵襲。在動物實驗中，XCR1過表達(dá)可降低移植瘤大小，與對照組移植瘤的差異均具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義(p＜0.01)，且成瘤率也明顯減低，只有50％。然而實驗組與對照組相比均未出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移情況，提示體內(nèi)復(fù)雜的信號通路參與其作用。軟件預(yù)測XCR1可降低ERα+乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者DFS，雖然沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但仍提示XCR1可能是ERα+乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不良預(yù)后因子。
　　結(jié)論:基因修飾后過表達(dá)X