TSP-1在激素性股骨頭壞死中的作用機(jī)制.pdf

1、目的:股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是骨科常見(jiàn)病，創(chuàng)傷性O(shè)NFH主要見(jiàn)于髖部創(chuàng)傷，而非創(chuàng)傷性O(shè)NFH最常見(jiàn)于過(guò)量激素和飲酒[1]。目前激素性股骨頭壞死已居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位[2，3]。激素性股骨頭壞死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)的臨床治療進(jìn)展緩慢，關(guān)節(jié)致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量

2、。因其發(fā)病機(jī)制還不清楚，迄今尚缺乏有效的防治方法。內(nèi)毒素可誘導(dǎo)血管的炎性反應(yīng)且能造成血管內(nèi)皮損傷，使血液呈血栓前高凝狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用大量的激素來(lái)誘導(dǎo)股骨頭發(fā)生壞死，此過(guò)程與臨床上SANFH的發(fā)病過(guò)程相似[4]。血小板反應(yīng)蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性多肽類(lèi)血管新生抑制劑，TSP-1通過(guò)抑制促血管生長(zhǎng)因子與其在內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合而間接抑制血管新生。那么TSP-1在激素性股骨頭壞死中的

3、作用機(jī)制如何？TSP-1基因敲除后對(duì)激素性股骨頭壞死的影響還不清楚。本課題擬采用內(nèi)毒素(LPS)聯(lián)合激素誘導(dǎo)小鼠股骨頭壞死。用TSP-1基因敲除型(TSP-1KO)小鼠和野生型小鼠為模型，比較TSP-1KO小鼠股骨頭壞死的情況。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)來(lái)探討:1.TSP-1基因在激素性股骨頭壞死中的表達(dá)。2.TSP-1基因?qū)に匦怨晒穷^壞死的影響。3.TSP-1基因?qū)δ[瘤壞死因子(TFN-a)、白介素1（IL-1β）表達(dá)的影響。
　　方法:取6

4、周齡C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為A、B組(n=10)。A組是空白對(duì)照組，B組是LPS聯(lián)合激素（甲潑尼龍琥珀酸鈉，甲強(qiáng)龍）組，C組是TSP-1K0組(n=6)。B、C組小鼠每只按50ug/kg劑量腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)，每天1次，連續(xù)2天。第3天按20mg/kg劑量開(kāi)始腹腔注射甲強(qiáng)龍，每天1次，連續(xù)3天。A組于同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。于第1次注射LPS后3周時(shí)處死A、B組小鼠各4只，觀察模型是否成功建立。取股骨頭和肝臟組織蘇

5、木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining HE)、免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）進(jìn)行觀察。取肝臟組織提取mRNA進(jìn)行PCR，檢測(cè)TSP-1基因的表達(dá)。6周時(shí)處死A、B、C組全部小鼠，取股骨頭和肝臟組織HE染色、免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行觀察，取三組小鼠肝臟組織提取mRNA進(jìn)行PCR，檢測(cè)TNF-α、IL-1β的表達(dá)。采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

6、差表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P＜0.01為有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P＜0.05為有差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; P＞0.05為無(wú)顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:3周時(shí)A、B組小鼠HE染色觀察:A組肝臟正常，肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰;股骨頭骨小梁完整，排列規(guī)則，骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，髓間脂肪細(xì)胞相對(duì)較少，形態(tài)正常。B組肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)小脂肪空泡，肝索結(jié)構(gòu)不清;股骨頭骨小梁較正常變細(xì)，部分?jǐn)嗔眩糠止羌?xì)胞邊聚、固縮，髓間脂肪細(xì)胞直

7、徑增大，數(shù)目增多;免疫組織化學(xué)觀察:A組骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)棕黃色顆粒多見(jiàn)、骨保護(hù)素配體(osteoprotegerin ligand，OPGL)棕黃色顆粒較少，陽(yáng)性染色率無(wú)明顯改變。B組骨保護(hù)素(osteoprotegerin OPG)陽(yáng)性表達(dá)棕黃色顆粒偶見(jiàn)，OPGL陽(yáng)性表達(dá)棕黃色顆粒較多。兩組肝臟提mRNA進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B組TSP-1基因表達(dá)明顯高于A組（P值＜0.05）。6周時(shí)處死A、B、C組全部

8、小鼠， HE染色觀察:A組肝臟正常，肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰;股骨頭骨小梁完整，排列規(guī)則，骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，髓間脂肪細(xì)胞相對(duì)較少，形態(tài)正常。B組肝細(xì)胞可見(jiàn)不均勻脂肪空泡，肝組織結(jié)構(gòu)模糊。股骨頭骨小梁稀疏，斷裂增加，骨細(xì)胞壞死空骨陷窩增多，髓間脂肪細(xì)胞多見(jiàn)。C組肝臟及股骨頭較A組變化不明顯。B組空骨陷窩明顯多于A、C組(P＜0.01)，A、C無(wú)顯著差異(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)觀察:A組3周和6周骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG

9、)棕黃色顆粒多見(jiàn)、骨保護(hù)素配體(osteoprotegerin ligand，OPGL)棕黃色顆粒較少，陽(yáng)性染色率無(wú)明顯改變;B組OPG陽(yáng)性率6周較3周時(shí)降低， OPGL陽(yáng)性率6周較3周時(shí)增高。C組OPG棕黃色顆粒多見(jiàn)、OPGL棕黃色顆粒較少。C組OPG陽(yáng)性率表達(dá)較A組稍降低，OPGL陽(yáng)性率表達(dá)較A組稍增高。 B組與A、C組比較，股骨頭OPG局部陽(yáng)性率表達(dá)明顯下降，OPGL局部陽(yáng)性率表達(dá)明顯上升，有明顯差異(P＜0.01)。A、C組間O

10、PG局部陽(yáng)性率表達(dá)稍降低，OPGL局部陽(yáng)性率表達(dá)稍增高，無(wú)顯著差異(P＞0.05)。3組肝臟提取mRNA進(jìn)行PCR檢測(cè)TNF-a、IL-1基因表達(dá)。B、C組均高于A組(P＜0.05)， C組低于B組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.激素性股骨頭壞死小鼠肝臟組織TSP-1基因表達(dá)明顯高于正常小鼠， TSP-1基因表達(dá)增高與股骨頭缺血壞死成正相關(guān)。
　　2.TSP-1KO，抑制了激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展。