膠原修飾溫致水凝膠包載GDF-5轉染脂肪干細胞修復大鼠椎間盤退變.pdf

1、第一部分過表達GDF-5基因大鼠脂肪千細胞構建的條件探索和篩選
　　目的:探索慢病毒介導過表達GDF-5基因大鼠脂肪干細胞(ASCs)的構建條件和純度篩選。
　　方法:取大鼠腹股溝脂肪墊組織，采用Ⅰ型膠原酶消化貼壁培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)大鼠ASCs。倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學，CCK-8法測定細胞生長曲線，流式細胞儀進行細胞表型鑒定。制備帶GDF-5/GFP嵌合基因的慢病毒載體系統(tǒng)，探索不同感染復數(shù)(MOI)(MOI=1，

2、5，10，20，40，60，80，100)的轉染效率，選擇最佳轉染復數(shù)，采用流式細胞儀檢測轉染效率。對轉染細胞行流式細胞篩選，測定篩選后轉染細胞的陽性率。篩選出的細胞行細胞爬片，DAPI染色，形態(tài)學上進一步驗證細胞陽性率。并采用CCK-8法檢測轉染后細胞活力。
　　結果:成功培養(yǎng)大鼠ASCs，流式細胞免疫表型鑒定:間充質(zhì)干細胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表達陽性，造血細胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓

3、干細胞表面抗原(CD106)表達陰性。成功構建GDF-5過表達慢病毒載體系統(tǒng)，慢病毒轉染大鼠ASCs最佳MOI為40，轉染率為65％。通過GFP熒光流式細胞篩選技術，可將轉染細胞陽性率提高至96％。體外傳代后陽性細胞率無明顯減少。CCK-8法檢測轉染后細胞活力、生長曲線與未轉染細胞無明顯差異。
　　結論:膠原酶消化法可成功培養(yǎng)大鼠ASCs。慢病毒介導GDF-5/GFP嵌合基因轉染大鼠ASCs的最佳MOI為40，轉染率為65％。流式

4、細胞篩選技術可顯著提高轉染細胞陽性率，對細胞活力無顯著影響。
　　第二部分過表達GDF-5基因大鼠ASCs的鑒定和分化評估
　　目的:評估轉染GDF-5基因大鼠ASCs表達GDF-5基因、蛋白的有效性，并評估其能否向髓核樣細胞分化。
　　方法:收集篩選后GDF-5基因轉染細胞，熒光定量Real-time PCR檢測GDF-5基因表達情況，Western Blot檢測檢測GDF-5蛋白表達。收集GDF-5基因轉染細胞培養(yǎng)

5、上清液，Elisa檢測上清液中GDF-5含量。細胞不添加額外誘導劑體外培養(yǎng)7天后，收集細胞行Real-time PCR檢測髓核樣細胞標記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表達情況，Western Blot檢測檢測Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表達情況。比較GDF-5基因轉染細胞與未轉染細胞在上述基因和蛋白表達的差異，評估基因轉染、蛋白表達的有效性，以及轉染GDF-5基因ASCs是否能顯著表達髓核樣細

6、胞標記物。對GDF-5基因轉染后細胞的行細胞爬片，免疫熒光染色觀察細胞內(nèi)Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的表達和胞內(nèi)定位。
　　結果:GDF-5慢病毒轉染組的基因和蛋白水平與空白對照組相比較均顯著性增高(P＜0.001)，說明目的基因轉染有效。Elisa法檢測細胞上清液中GDF-5含量為（151.7±33.2）ng/ml，顯著性高于空白對照組(P＜0.001)。細胞培養(yǎng)7天后，Real-time PCR、Wester

7、n Blot結果顯示三種髓核樣細胞標記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的基因和蛋白表達水平，GDF-5慢病毒轉染組均顯著性高于空白對照組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。免疫細胞熒光從形態(tài)學上證明轉染GDF-5的ASCs髓核細胞樣標記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan呈陽性表達。其中Sox9主要表達在細胞核、CollagenⅡ主要表達在胞質(zhì)中，Aggrecan在胞質(zhì)和細胞核中均有表達。
　　結論:過表

8、達GDF-5基因大鼠ASCs可有效表達GDF-5基因和蛋白，并能分泌至細胞外，且在不額外添加誘導劑的情況下能在基因、蛋白及形態(tài)學上向髓核樣細胞分化。
　　第三部分膠原修飾溫致水凝膠的制備和生物相容性評估
　　目的:制備Ⅱ型膠原修飾的溫致水凝膠（Collagen/Hydrogels），進行表征測定和評估其生物相容性。
　　方法:采用開環(huán)聚合方法合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝膠，0.1％Ⅱ型膠原修飾后行鈷6

9、0輻照滅菌，核磁共振及體積排除色譜測定輻照前后凝膠分子量，倒管法及流變儀測定相轉變溫度。測定修飾后前后凝膠的體外降解過程中的物理形貌及浸提液pH。MTT法測定凝膠包載細胞后的細胞活力，流式細胞儀AnnexinⅤ/PI法測定含修飾后凝膠培養(yǎng)液能否致使細胞凋亡或死亡。大鼠頸部皮下埋植檢測其體內(nèi)生物相容性。
　　結果:采用開環(huán)聚合方法可成功合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝膠，Ⅱ型膠原修飾及鈷60輻照滅菌后凝膠分子量無明顯變

10、化，對成膠溫度無顯著影響。膠原修飾后對凝膠形態(tài)學維持有所提高，降解產(chǎn)物浸提液的pH呈中性。MTT檢測結果表明細胞在膠原修飾后凝膠中的活力相比在單純凝膠中得到有效提高。流式細胞凋亡測試表明不同梯度的含膠原修飾后凝膠的培養(yǎng)液不會導致細胞凋亡或死亡。皮下埋植實驗未見炎性細胞浸潤，表明凝膠體內(nèi)組織相容性好。
　　結論:Ⅱ型膠原對PCLA-PEG-PCLA水凝膠支架進行修飾可提高其細胞粘附活性和增殖能力，對凝膠本身的溫敏性無顯著影響。修飾后

11、的水凝膠具有良好的細胞相容性和組織相容性
　　第四部分膠原修飾溫致水凝膠包載過表達GDF-5脂肪干細胞修復大鼠椎間盤退變
　　目的:評估膠原修飾溫致水凝膠包載GDF-5基因轉染脂肪干細胞(ASCs)修復大鼠椎間盤退變的效果。
　　方法:采用膠原修飾溫致水凝膠包載轉染GDF-5脂肪干細胞(ASCs)包載移植細胞，X線透視下用21G穿刺針針刺大鼠尾椎纖維環(huán)至髓核中央，進行抽吸，在Co5/Co6、Co7/Co8、Co8/Co

12、9間盤水平進行操作，Co6/Co7為正常對照。針刺后，Co5/Co6間盤通過微量注射器給予PBS2μl，作為陰性對照組。Co7/Co8、Co8/Co9間盤按不同處理措施分組如下:(1)ASCs-GDF5+Col/Gel組:膠原修飾水凝膠中包載GDF-5基因轉染的大鼠ASCs;(2) ASCs-GDF5+Gel組:單純水凝膠中包載GDF-5基因轉染的大鼠ASCs;(3) ASCs-GDF5+PBS組:含GDF-5基因轉染大鼠ASCs的PB

13、S液;(4) ASCs+Col/Gel組:膠原修飾水凝膠中包載無GDF-5基因轉染的大鼠ASCs;(5) ASCs+Gel組:單純水凝膠中包載無GDF-5基因轉染的大鼠ASCs;(6) ASCs+PBS組:含無DF-5基因轉染大鼠ASCs的PBS液;(7) Col/Gel組:僅注射膠原修飾水凝膠;(8) Gel組:僅注射單純水凝膠溶液。注射液體體積均為2μl。移植后每兩周通過細胞自帶GFP應該觀察細胞存活情況。移植30天、60天、90天

14、后行大鼠尾椎X線檢查，計算并比較相對椎間隙指數(shù)(DHI(％))變化，并行HE染色、番紅O-快綠染色、甲苯胺藍染色進行組織學評估。
　　結果:體內(nèi)示蹤表明移植后4周仍可觀察到移植細胞GFP熒光，形態(tài)學上有分化。對同一時間點不同處理組DHI(％)比較:ASCs-GDF5+Col/Gel組、ASCs-GDF5+PBS組、ASCs+Col/Gel組在移植后三個時間點均顯著高于PBS組(P＜0.05)。移植后90天，ASCs-GDF5+Ge

15、l組、ASCs+PBS組的DHI(％)也均優(yōu)于PBS組（P＜0.05）。對同一處理組在不同時間點DHI(％)比較:ASCs-GDF5+Col/Gel組與ASCs+Col/Gel組移植90天后與移植30天相比DHI(％)均得到了一定提高，結果具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。ASCs-GDF5+Gel組、ASCs-GDF5+PBS組及ASCs+PBS組在三個時間段中DHI(％)無顯著性變化(P＞0.05)，而ASCs+Gel組、Col/Ge

16、l組、Gel組及PBS組的DHI(％)在三個時間點呈下降趨勢，結果有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　陰性對照PBS組在針刺造模30天后椎間盤發(fā)生退變，說明椎間盤模型制備成功。HE組織學評分，在移植術后同一時間點中，ASCs-GDF5+Col/Gel組、ASCs-GDF5+Gel組、ASCs-GDF5+PBS組、ASCs+Col/Gel組的HE染色組織學評分結果要顯著低于陰性對照PBS組，結果均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。在所有

17、組別中ASCs-GDF5+Col/Gel組評分顯著低于其他組(P＜0.05)，修復效果椎間盤效果最為顯著。ASCs-GDF5+Col/Gel組在移植后的三個時間點中，組織學評分無顯著性升高(P＞0.05)，而其它組在穿刺移植術后90天相比術后30天，組織學評分顯著性升高(P＜0.05)。所有組的間盤均未見炎性細胞浸潤等急性或慢性炎癥的組織學表現(xiàn)。
　　結論:Ⅱ型膠原修飾的PCLA-PEG-PCLA水凝膠包載過表達GDF-5基因大鼠