胎大鼠腸神經(jīng)干細(xì)胞的提取及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腸神經(jīng)元缺陷性疾病是一種潛在的、具有臨床應(yīng)用前景的根治方法,腸神經(jīng)干細(xì)胞(Enteric neural stem cells,ENSCs)可能是合適的移植干細(xì)胞源.本研究從胎大鼠消化道分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(Central nervous system-derivedneural stem ceils,CNS-NSCs),進(jìn)行增殖和分化特性比較研究,為開展進(jìn)一步腸神經(jīng)干細(xì)胞的移植應(yīng)用

2、提供依據(jù). 方法： 1.采用改良的ENSCs培養(yǎng)液,以反復(fù)傳代法從胚胎20天SD大鼠提取神經(jīng)干細(xì)胞. 2.進(jìn)行Nestin、Tui-1、GFAP和SMA免疫熒光化學(xué)染色,以確定分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為ENSCs. 3.同時(shí)從同一胞胎鼠分離培養(yǎng)ENSCs和CNS-NSCs,分別比較兩者的神經(jīng)球生長(zhǎng)情況. 4.CCK-8測(cè)定的兩種神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度. 5.流式細(xì)胞儀測(cè)定、比較兩種神經(jīng)干細(xì)胞Tuj-

3、1、GFAP、Nestin、Ret染色陽(yáng)性細(xì)胞比例. 結(jié)果： 1.培養(yǎng)第3-5天,見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng);第6-7天,貼壁細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu):第9-10天,懸浮生長(zhǎng)的腸神經(jīng)球形成. 2.通過(guò)我們使用的ENSCs培養(yǎng)液及分離培養(yǎng)方法,培養(yǎng)的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin,能分化成為表達(dá)Tuj-1的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及表達(dá)SMA的平滑肌細(xì)胞,確認(rèn)為ENSCs. 3.ENSCs早期呈貼壁生長(zhǎng),神經(jīng)球生長(zhǎng)速

4、度慢于CNS-NSCs,但神經(jīng)球表面常有長(zhǎng)的突起,并相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀. 4.兩種神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)第三天,CCK-8測(cè)定ENSCs的細(xì)胞增殖速度要慢于CNS-NSCs(P<0.05). 5.流式細(xì)胞儀測(cè)定ENSCs和CNS-NSCs的Tuj-1陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為12.3﹪和11.4﹪(P>0.05). 6.流式細(xì)胞儀測(cè)定兩種干細(xì)胞GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為21.7﹪和22.5﹪(P>0.05). 7.流式

5、細(xì)胞儀測(cè)定兩種干細(xì)胞Nestin陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為10.8﹪和10.8﹪(P>0.05). 8.流式細(xì)胞儀測(cè)定兩種干細(xì)胞Ret陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為1.4﹪和7.0﹪(P<0.05). 結(jié)論： 1.通過(guò)我們使用的ENSCs培養(yǎng)液及分離培養(yǎng)方法,能夠培養(yǎng)出腸神經(jīng)干細(xì)胞. 2.培養(yǎng)的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin,能分化為表達(dá)Tui-1的神經(jīng)元、表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)SMA陽(yáng)性的的平滑肌細(xì)胞,確認(rèn)為腸神經(jīng)干細(xì)