日本腦炎病毒W(wǎng)He株基因組特征及其疫苗的研究.pdf

1、日本腦炎(Japanese Encephalitis，JE)，又稱流行性乙型腦炎，是由日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)人畜共患急性傳染病。其致死率高達(dá)30％左右，50％的患者會(huì)留下永久性的后遺癥，其中，中國(guó)的JE發(fā)病數(shù)占世界總發(fā)病數(shù)的80％以上。庫(kù)蚊伊蚊是該病的主要傳播媒介，而豬則是重要的傳染源和放大器。豬患JE的主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔、公豬睪丸炎及少數(shù)仔

2、豬呈神經(jīng)癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，用于JE免疫預(yù)防的疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種，其安全性和較高的生產(chǎn)應(yīng)用成本已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)，病毒分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)的發(fā)展為開發(fā)新型JE疫苗提供了新的技術(shù)手段。 本研究為進(jìn)一步探索JEV/WHe株基因組功能、致病機(jī)理及構(gòu)建高效新型疫苗，開展了以下工作： 1．JEV/WHe株全基因組特征分析本研究設(shè)計(jì)了11對(duì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到覆蓋J

3、EV/WHe株基因組全長(zhǎng)cDNA的11個(gè)特異性片段，測(cè)序分析表明，JEV/WHe株基因組由一個(gè)開放閱讀框(ORF，10296個(gè)核苷酸)和5′端非編碼區(qū)(5′UTR，95個(gè)核苷酸)和3′端非編碼區(qū)(3′UTR，585個(gè)核苷酸)組成。 核苷酸序列和氨基酸序列分析表明，WHe株與P3株親緣關(guān)系最近，但3′UTR形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)與Vellore P20778株3′UTR形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)最相似：與黃病毒科其他屬成員比較，3′UTR最末端約84

4、個(gè)核苷酸所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守。 Whe株與P3株的膜蛋白(E)擁有M(76)、G(306)和L(408)三個(gè)特有氨基酸，而在其它19株JEV為T(76)、E(306)、S(408)，推測(cè)可能與病毒的宿主及組織嗜性有關(guān)。Whe株E蛋白中存在控制黃病毒毒力的RGD(387-389)基序，而一部分弱毒株也有該基序，提示JVE毒力型的決定簇具有毒株特異性。由全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖與由E基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖僅有一些細(xì)微的差別，表

5、明E基因在研究各分離株之間進(jìn)化關(guān)系中具有重要意義；從GenBank中調(diào)出不同時(shí)間和地區(qū)分離的140株JEV E基因，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育圖譜。 2．JEV/Whe株全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)鏈RT-PCR法擴(kuò)增采用長(zhǎng)鏈RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組全長(zhǎng)cDNA。對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并對(duì)含復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的3′末端和5′末端非編碼區(qū)擴(kuò)增片段進(jìn)行了測(cè)序分析。擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增出的JEV Whe株基因組全長(zhǎng)cDNA分子近11kb大??；非編碼區(qū)測(cè)序分析表明

6、，擴(kuò)增產(chǎn)物為Wae株所特有。證明長(zhǎng)鏈RT-PCR法可用于JEVWHe株基因組全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增。 3．JEV/Whe株ONA疫苗載體構(gòu)建采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增prM/E和NS1全基因并進(jìn)行序列分析，將其分別克隆于真核表達(dá)載體pAVX1，構(gòu)建的表達(dá)載體pAVX1prM/E和pAVX1-NS1，酶切鑒定和序列分析表明，JEV/Whe株DNA疫苗載體構(gòu)建成功。 4．Whe株NS1基因在大腸桿菌中的表達(dá)將NS1基因克隆到pET