流感病毒血凝素轉位結構域的截短體-突變體的活性在靶向促凋亡分子中的應用.pdf

1、本課題的研究目標是對流感病毒血凝素轉位結構域(HA2)進行截短和突變,篩選獲得長度最短、轉位功能較強的HA2優(yōu)化短肽,用于靶向促凋亡分子的構建。在本課題組前期的工作中,已將HA2引入到靶向促凋亡分子中,體內(nèi)外實驗證實其具有轉位活性,能夠促進殺傷效應分子從內(nèi)吞體轉位到胞漿,增強抗腫瘤作用。在此基礎上,本研究對HA2進行改構優(yōu)化,設計獲得了6種截短體和3種突變體,通過體外紅細胞溶解實驗、腫瘤細胞殺傷實驗和熒光共振能量轉移實驗(FRET)比較

2、這些HA2截短體/突變體的轉位功能強弱。
　　首先,我們利用體外紅細胞溶解實驗對HA2改構體進行功能篩選,如果破壞紅細胞膜的能力越強,就會導致上清中血紅蛋白含量越高,表明HA2改構體的轉位功能越強。以野生型HA2作為對照,將合成的上述9種HA2截短體/突變體與分離的人外周血紅細胞相孵育。劑量效應實驗和時間效應實驗的結果均表明,在相同條件下E5C3的溶血能力強于HA2,E5弱于HA2,并且呈現(xiàn)出時間依賴關系和某種程度的劑量依賴關系。

3、羧基端的3個截短體C3、C15、C8中,僅C3具有溶血能力,提示HA2的2個螺旋區(qū)對于溶血功能至關重要,去掉一個或兩個均會使HA2喪失溶血功能。氨基端的2個截短體N15和N3均喪失了溶血活性,說明氨基端第一個氨基酸的重要性,與文獻報道一致。而中間截短體M7、E5C3M7在增大劑量或延長時間時,其溶血百分率均遠遠低于HA2,表明中間氨基酸殘基可能對HA2的溶血功能有貢獻。通過體外紅細胞溶解實驗,我們選出5個HA2截短體/突變體進行下一步細

4、胞內(nèi)的功能篩選,其中HA2作為陽性對照,E5C3的轉位功能明確、強于HA2,C15、M7、E5C3M7的轉位功能微弱,遠低于HA2。
　　其次,利用腫瘤細胞殺傷實驗對HA2改構體進行功能篩選。將HA2截短體/突變體引入本組前期構建的其中一種靶向促凋亡分子中,如果這些重組分子對腫瘤細胞的殺傷作用越強,就表明HA2改構體的轉位功能越強。本研究構建了5種e23sFv-Fdt-HA2截短體/突變體-tBid,分別轉染兩種HER2陽性乳腺癌

5、細胞BT474和SKBR3,流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果表明,E5C3的轉位效率強于野生型HA2;E5C3M7、C15、M7的轉位效率弱于HA2。
　　最后,利用FRET實驗對HA2改構體進行功能篩選。將HA2截短體/突變體插入EGFP(FRET供體)和mCherry(FRET受體)之間,構建HBsAg靶向的融合指示分子,如果FRET信號丟失越多、mCherry彌散分布的程度越高,就表明HA2改構體的轉位功能越強。構建了5種sc

6、Fv15-EGFP-Fdt-HA2截短體/突變體-mCherry,穩(wěn)定轉染COS7細胞并建系,預實驗顯示COS7細胞分泌表達的scFv15-EGFP-Fdt-HA2-mCherry可內(nèi)化進入乙肝表面抗原(HBsAg)陽性肝癌細胞PLC/PRF5中,并且呈內(nèi)吞體顆粒狀分布,為進一步優(yōu)化FRET檢測窗口、分析mCherry亞細胞分布比率提供了初步的實驗依據(jù)。
　　經(jīng)過上述實驗驗證,HA2的突變截短體E5C3具有更強的轉位功能,為下一步