硫氧還蛋白過氧化物酶Peroxiredoxin Ⅱ與前列腺癌關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景與目的：硫氧還蛋白過氧化物酶家族最初發(fā)現(xiàn)于酵母中，構(gòu)成了一個(gè)與既往的抗氧化蛋白無同源性的抗氧化物酶家族。目前從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)道有一百多個(gè)具有高度保守蛋白結(jié)構(gòu)域的同系物。硫氧還蛋白過氧化物酶家族在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，如抗氧化損傷保護(hù)蛋白和脂質(zhì)，細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等。增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平可抗凋亡。硫氧還蛋白過氧化物酶家族是紅細(xì)胞中主要的抗氧還劑，并且介導(dǎo)早期紅細(xì)胞系的分化。該家族所包含的一

2、類過氧化物酶，能夠利用其活性半胱氨酸殘基清除過氧化物及羥基。
　　 根據(jù)氨基酸序列的差異，硫氧還蛋白過氧化物酶家族有六個(gè)亞型，并被分為兩大亞家族。亞家族一含有兩個(gè)保守性半胱氨酸殘基，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)亞型，亞家族二擁有一個(gè)保守性半胱氨酸殘基，包括Ⅴ和Ⅵ兩個(gè)亞型。Ⅰ和Ⅱ亞型位于胞漿中。
　　 與細(xì)胞增殖、分化、抗凋亡及腫瘤相關(guān)。研究表明，硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ在紅細(xì)胞及K-562紅白血病細(xì)胞系中作為巰基特異性的抗氧還劑

3、。
　　 硫氧還蛋白過氧化物酶家族在某些腫瘤組織中高表達(dá)。硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在人乳腺癌組織中過表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)展和分級(jí)相關(guān)。硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅰ在肺癌、甲狀腺瘤及口腔腫瘤中也有高表達(dá)，是潛在的腫瘤標(biāo)記物。
　　 硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ是酵母的硫氧還蛋白過氧化物酶的人類同源體，又名硫氧還蛋白依賴的過氧化物還原酶Ⅰ(thioredoxin-dependent peroxide reductase1，TDPX1

4、)或自然殺傷增強(qiáng)因子B(natural killer-enhancing factor-B，NEKF-B)，位于染色體13q12，在人神經(jīng)元細(xì)胞有表達(dá)，但在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)。
　　 硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ可利用硫氧還蛋白作為直接的電子供體發(fā)揮降解過氧化氫及其他活性氧類物質(zhì)的作用。其過氧化物酶活性能保護(hù)細(xì)胞免于活性氧的損傷。
　　 硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ因其對(duì)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫濃度調(diào)節(jié)作用，參與了生長(zhǎng)因子和腫瘤壞死因子α的細(xì)

5、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 目前研究表明，硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ具有硫氧還蛋白依賴的過氧化物酶活性，能夠抑制細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞膜結(jié)合，與紅細(xì)胞中鈣離子激活的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。
　　 在既往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在皮膚組織中至少有三種硫氧還蛋白過氧化物酶亞型存在，而硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ主要存在于真皮層的上皮細(xì)胞及其附屬結(jié)構(gòu)中(毛囊、汗腺及皮脂腺中)，我們還發(fā)現(xiàn)，硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ存在于正常皮膚的血管內(nèi)皮細(xì)胞中。硫氧還蛋白過氧化物酶

6、Ⅱ存在于紅細(xì)胞及人臍內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，同時(shí)表達(dá)于人體表皮膚的良惡性血管瘤。因其高表達(dá)于血管內(nèi)的紅細(xì)胞中，甚至可作為檢測(cè)組織樣本中的血管標(biāo)記物。
　　 硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ不僅能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)賦予腫瘤細(xì)胞抗過氧化氫、順鉑和抗輻射的能力。硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ可在過氧化氫及順鉑的作用下表達(dá)上調(diào)，并能抑制順鉑、促甲狀腺激素、血漿剝奪、神經(jīng)酰胺及鬼臼乙叉甙引起的細(xì)胞凋亡，因此硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ的過表達(dá)可導(dǎo)致化療

7、耐藥。研究表明，硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ還能介導(dǎo)輻射抵抗。
　　 在既往的研究中，我們通過二維電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Prx II蛋白在高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞系PC-3M-1E8的表達(dá)水平較低轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞系PC-3M-2B4明顯下調(diào)。為了研究前列腺癌的分子機(jī)制，闡明Prx II基因和前列腺癌的相關(guān)性，我們對(duì)Prx II基因進(jìn)行了深入的研究?；赑rx II基因在不同轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞中存在表達(dá)異常和功能障礙，通過藥物或者遺傳修飾

8、等手段控制Prx II基因的功能或它們的調(diào)節(jié)通路，將是一個(gè)令人振奮但又出人意料的分子治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 運(yùn)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot法檢測(cè)配對(duì)高低轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞系中Prx II mRNA及蛋白的表達(dá)水平；采用基因工程技術(shù)構(gòu)建Prx II全長(zhǎng)真核表達(dá)載體，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Prx II的前列腺癌細(xì)胞克隆株；應(yīng)用RT-PCR、cfse-流式細(xì)胞測(cè)定和體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等方法觀察1E8

9、/Prx II細(xì)胞增殖及其運(yùn)動(dòng)能力的變化；應(yīng)用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)1E8/Prx II 細(xì)胞和1E8/pcDNA3.1細(xì)胞中AKT、P-AKT、E-cadherin、β-catenin和Bcl-X/L的表達(dá)變化；采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)1E8/Prx II 細(xì)胞和1E8/pcDNA3.1細(xì)胞的增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、體外侵襲和黏附能力。另外，為了篩選在前列腺癌細(xì)胞中與PrxⅡ蛋白

10、相互作用的蛋白，我們應(yīng)用酵母雙雜交體系,構(gòu)建人PrxⅡ蛋白酵母雙雜交誘餌載體，將該基因片段與pGBKT7載體定向重組，將序列正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-PrxⅡ轉(zhuǎn)化入AH109酵母菌株,在缺陷性培養(yǎng)基上觀察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表達(dá)情況,檢測(cè)誘餌載體有無毒性作用和單倍體及二倍體自激活功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.Prx II mRNA和蛋白水平在高轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞系PC-3M-1E8的表達(dá)水平較低

11、轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞系PC-3M-2B4明顯下調(diào)，表明Prx II基因的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，2．成功構(gòu)建了Prx II基因的全長(zhǎng)真核表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)Prx II的前列腺癌細(xì)胞克隆株1E8/Prx II和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的對(duì)照細(xì)胞克隆株1E8/pcDNA3.1。
　　 3．通過轉(zhuǎn)染技術(shù)使人前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞過表達(dá)Prx II，能夠抑制細(xì)胞體外增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，同時(shí)，Prx II的過表達(dá)促進(jìn)

12、丁基過氧化氫(TBHP)引起的前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，可能是通過下調(diào)PI4K/AKT胞內(nèi)信號(hào)對(duì)PC-3M-1E8細(xì)胞發(fā)揮作用的。
　　 4．過表達(dá)外源性Prx II，通過使AKT失活、調(diào)控內(nèi)化的E-cadherin的再循環(huán)，增加E-cadherin/catenin復(fù)合物形成，改變了細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)，抑制人前列腺癌細(xì)胞系PC-3M-1E8細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型。
　　 5．成功構(gòu)建pGBKT7-PrxⅡ重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化有重

13、組質(zhì)粒和pGBKT7空載體的酵母菌都能在SD/-Trp/X-α-gal 平板上長(zhǎng)出粉紅色菌落,在SD/-His /-Trp /X-α-gal,SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上不能生長(zhǎng),并將pGBKT7-PrxⅡ誘餌質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109,且對(duì)酵母菌株AH109無毒性，不具自主激活報(bào)告基因的功能。
　　 結(jié)論：驗(yàn)證PrxⅡ在不同高低轉(zhuǎn)移配對(duì)前列腺癌細(xì)胞株的表達(dá)顯示，PrxⅡ基因的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，使

14、人前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞過表達(dá)Prx II，能夠抑制細(xì)胞體外增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，同時(shí)，Prx II的過表達(dá)促進(jìn)丁基過氧化氫(TBHP)引起的前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。
　　 進(jìn)一步探討PrxⅡ基因參與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)：外源性PrxⅡ過表達(dá)，下調(diào)PI4K/AKT 胞內(nèi)信號(hào)，抑制人前列腺癌PC-3M-1E8 細(xì)胞的體外增殖和運(yùn)動(dòng)能力；PrxⅡ的過表達(dá)抑制AKT 活化，調(diào)控內(nèi)化的E-cadherin的再循