成纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3）在小鼠骨形成過程中作用和機(jī)制的研究.pdf

1、目的： FGFR3是骨骼發(fā)育過程中重要的調(diào)控分子，主要通過抑制軟骨細(xì)胞增生、分化來抑制軟骨形成過程，其功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變可以導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia，ACH)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)FGFR3能夠影響骨形成過程，但具體作用和分子機(jī)制還不清楚。本研究旨在明確FGFR3是否通過降低軟骨細(xì)胞分泌BMP4間接影響骨形成過程。 方法 1．細(xì)胞試驗(yàn)： (1)原代培養(yǎng)ACH、野生型小鼠軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，利用Tr

2、answell<'TM>建立不同基因型軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)模型； (2)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測成骨細(xì)胞與不同軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后以及單獨(dú)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中cbfa-1、OP、OC等標(biāo)記基因的表達(dá)差異，同時(shí)檢測ACH和野生型軟骨細(xì)胞BMP4的表達(dá)差異； (3)鑒于BMP2于BMP4有極高同源性，且相互之間功能可以代償，故通過在與ACH軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)組加入外源性rh-BMP2，定量檢測成骨細(xì)胞cbfa-1、OP、OC

3、等成骨標(biāo)記基因的表達(dá)，并與野生型軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)組及單獨(dú)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行比對研究。 2．胚胎脛骨培養(yǎng)試驗(yàn)： (1)建立小鼠16.5天胚胎脛骨體外培養(yǎng)模型； (2)在培養(yǎng)的ACH胚胎一側(cè)脛骨加入外源性rh-BMP2后，與對側(cè)脛骨比較，從大體測量、藏紅-固綠染色及定量檢測cbfa-1、OP、OC等基因表達(dá)評估其骨形成功能，并與培養(yǎng)的對側(cè)脛骨及野生型脛骨進(jìn)行比對研究。 結(jié)果 1．細(xì)胞試驗(yàn)： 共培

4、養(yǎng)組的成骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)均較成骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組高，且與ACH軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)組的成骨細(xì)胞cbfa-1、OP、OC等標(biāo)記基因的表達(dá)較與野生型軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)組明顯降低，表明成骨功能受到抑制。與之相對應(yīng)的是ACH軟骨細(xì)胞中BMP4的表達(dá)與野生型軟骨細(xì)胞相比也明顯降低。在加入外源性的rh-BMP2后，ACH共培養(yǎng)組的成骨細(xì)胞cbfa-1、OP、OC等基因的表達(dá)水平顯著升高，成骨功能得到恢復(fù)。 2．胚胎脛骨培養(yǎng)試驗(yàn)： 培養(yǎng)的ACH