PTX3過表達(dá)與沉默對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)攝取與流出的影響及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、背景：目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對“入侵”動(dòng)脈壁的致病性脂蛋白所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng),在動(dòng)脈粥樣硬化各個(gè)階段都可以見到炎癥反應(yīng)的存在。脂質(zhì)代謝的異常和血管壁的慢性炎癥是AS發(fā)生和發(fā)展過程中的重要特征。很多炎癥因子可以同時(shí)參與炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。正五聚蛋白3(PTX3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)炎癥因子,屬于長鏈正五聚蛋白,與動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈疾病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)修飾后的脂蛋白可以誘導(dǎo)人血管平滑肌源性泡沫細(xì)胞表達(dá)P

2、TX3,并且很多研究證明了在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展期,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脂核中的巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞表達(dá)大量的PTX3。盡管目前有很多研究發(fā)現(xiàn)PTX3在富于脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞中呈高表達(dá),但其是否對巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)攝取和流出產(chǎn)生影響及相關(guān)機(jī)制仍不清楚。
　　目的：通過研究PTX3對人和小鼠巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)與膽固醇流出的影響及其潛在機(jī)制,探討其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)人巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)

3、胞和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pSG5hPTX3或PTX3siRNA質(zhì)粒,與ox-LDL和/或[3H]-膽固醇等共同培養(yǎng)。各組經(jīng)相應(yīng)處理后,采用酶法,通過熒光分光光度計(jì)檢測細(xì)胞的總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)含量,并計(jì)算膽固醇酯(CE)含量;用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞的[3H]-膽固醇含量,并計(jì)算膽固醇流出率。用Real time-PCR和Western blot的方法檢測各組細(xì)胞中PTX3、PPARγ、LXRα和

4、ABCA1等基因和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.熒光酶法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,50μg/ml ox-LDL刺激THP-1細(xì)胞空載體轉(zhuǎn)染組24h后其TC,FC,CE和CE/TC(％)含量分別為298±15nmol/mg,205±9nmol/mg,94±21nmol/mg,31±5.7％,與未加ox-LDL刺激的空質(zhì)粒組對比具有顯著性意義(P<0.05);PSG5hPTX3轉(zhuǎn)染+ox-LDL刺激組與空載體轉(zhuǎn)染+ox-LDL刺

5、激組比較,可見膽固醇含量顯著增高(P<0.05),分別為380±15nmol/mg,223±10nmol/mg,157±21nmol/mg,41±4.1％;而ERK1/2通路抑制劑PD98059加入后可顯著抑制ox-LDL的攝取(P<0.05),其膽固醇含量分別為282±19nmol/mg,217±20nmol/mg,71±3nmol/mg,25±1.7％;另外,50μg/ml ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞空載體轉(zhuǎn)染組24h后其

6、TC,FC,CE和CE/TC(％)含量較未加ox-LDL刺激的空質(zhì)粒對照組顯著增高(P<0.05),分別為419±23nmol/mg,238±16nmol/mg,182±17nmol/mg,43±3％;PSG5hPTX3轉(zhuǎn)染+ox-LDL刺激組與pSG5空載體轉(zhuǎn)染+ox-LDL刺激組比較,可見膽固醇含量顯著增高(P<0.05),分別為551±15nmol/mg,261±23nmol/mg,291±27nmol/mg,53±4.2％;而p

7、38/MAPK-2通路抑制劑SB203580加入后可顯著抑制ox-LDL的攝取(P<0.05),其膽固醇含量分別為275±17nmol/mg,188±13nmol/mg,88±15nmol/mg,32±4.1％。
　　2.膽固醇流出的結(jié)果顯示,與pSG5空載體轉(zhuǎn)染組相比,PSG5hPTX3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞組的膽固醇流出率分別下調(diào)了33％和29％;而PTX3siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞組,其PT

8、X3被沉默,載脂蛋白A-I介導(dǎo)的膽固醇流出明顯上調(diào),與GFP空載體轉(zhuǎn)染組相比,分別上調(diào)了27％和21％。另外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),與PSG5hPTX3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,ERK1/2通路抑制劑PD98056可阻斷PTX3過表達(dá)的THP-1巨噬細(xì)胞組的膽固醇流出率約27％,而p38/MAPK-2通路抑制劑SB203580加入后可阻斷hPTX3過表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞組的膽固醇流出率達(dá)34％。
　　3.PTX3在THP-1和RAW264.7巨

9、噬細(xì)胞系過表達(dá)后可顯著下調(diào)PPARγ、LXRα和ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05),而PTX3沉默后,PPARγ、LXRα和ABCA1的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論：PTX3可以促進(jìn)THP巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞對ox-LDL的攝取并抑制apoA-I介導(dǎo)的膽固醇流出,ERK1/2通路或p38/MAPK通路可能分別參與了該過程。PTX3也可通過下調(diào)PPARγ、LXRα和ABCA1這些膽固醇流出相關(guān)分子的表達(dá)