生防菌淡紫擬青霉的基因組及其抗生素leucinostatins生物合成途徑的研究.pdf

1、植物寄生線蟲寄主廣泛，每年在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于化學(xué)防治對環(huán)境污染嚴(yán)重并且威脅人畜的健康，生物防治越來越受到人們的關(guān)注。淡紫擬青霉是農(nóng)業(yè)上一種非常重要的生防真菌，對植物寄生線蟲具有很好的生防作用。此外，淡紫擬青霉對枯萎病、棉花蚜蟲和切葉蟻等多種病蟲害具有很好的防治作用。淡紫擬青霉能夠寄生于線蟲卵，在侵染的過程中，幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶等多種水解酶類和蛋白酶類發(fā)揮重要作用。次級代謝產(chǎn)物也在防控病蟲害過程中起了不可或缺的作用。

2、Leucinostatins是從淡紫擬青霉發(fā)酵液中分離到的一種脂肽類抗生素，具有抗腫瘤細(xì)胞、抗細(xì)菌、抗真菌、抗錐形蟲等生物活性。對于leucinostatins分子生物學(xué)方面的研究，包括合成基因以及合成途徑，目前還沒有報道。本研究的目的是通過對兩個淡紫擬青霉菌株（PLBJ-1和PLFJ-1）進(jìn)行基因組測序，揭示淡紫擬青霉的基因組特征，鑒定leucinostatins合成酶基因簇，解析leucinostatins的合成途徑。
　　為

3、了開展淡紫擬青霉基因功能的研究，開發(fā)了該菌的 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系。對淡紫擬青霉菌株P(guān)LBJ-1進(jìn)行了GFP轉(zhuǎn)化。紫外光激發(fā)下，轉(zhuǎn)化菌株在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，并且單孢繼代培養(yǎng)六代后，熒光能夠穩(wěn)定遺傳。
　　基因組數(shù)據(jù)表明，PLBJ-1和PLFJ-1的基因組大小分別為38.14 Mb和38.53 Mb，分別含有144和163個scaffold，兩個菌株的重復(fù)序列含量分別為6.07％和6.00%，分別預(yù)測出11773

4、和11763個蛋白編碼基因。PLBJ-1與PLFJ-1的共線性分析表明兩個菌株具有很好的共線性關(guān)系。對淡紫擬青霉的主要蛋白家族進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩個菌株均具有較多的水解酶類、蛋白酶類和致病相關(guān)蛋白等家族的合成基因。用單拷貝同源蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與淡紫擬青霉關(guān)系最近的是Tolypocladium inflatum和Tolypocladium ophioglossoides，三個線蟲寄生菌（淡紫擬青霉、Hirsutella minne

5、sotensis和Pochonia chlamydosporium）分別與昆蟲寄生菌（T.inflatum、Ophiocordyceps sinensis和Metarhizium anisopliae）聚到同一分支上，說明線蟲寄生菌與昆蟲寄生菌很可能具有共同的祖先。淡紫擬青霉的基因組中共編碼13個PKS、10個NRPS、兩個PKS-like、10個NRPS-like、1個DMATS、4個TS和1個PKS-NRPS雜合體，表明淡紫擬青霉具

6、有很大的天然產(chǎn)物開發(fā)的潛力。
　　基于leucinostatins的結(jié)構(gòu)以及淡紫擬青霉中次級代謝產(chǎn)物合成基因的預(yù)測，確定了VFPBJ_02539為leucinostatins合成酶的候選基因。對lcsA基因進(jìn)行同源敲除，得到VFPBJ_02539基因功能缺失的轉(zhuǎn)化子ΔlcsA。對PLBJ-1的野生型菌株與突變體ΔlcsA發(fā)酵液的粗提物進(jìn)行HPLC比較分析，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株的粗提物相比，ΔlcsA的粗提物少了兩種物質(zhì)。對這兩個峰進(jìn)行

7、質(zhì)譜鑒定，同時與 leucinostatin A和 B的標(biāo)準(zhǔn)品比對分析，結(jié)果表明ΔlcsA缺失的兩個物質(zhì)為leucinostatin A和B，證明了NRPS合成酶基因lcsA負(fù)責(zé)leucinostatins的生物合成。
　　比較在兩種培養(yǎng)基（誘導(dǎo)leucinostatins產(chǎn)生的Lab-made-PDB和非誘導(dǎo)leucinostatins產(chǎn)生的PDB-BD）中與lcsA相關(guān)的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lcsG到lcsT共20個基因處于共表

8、達(dá)的狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及野生型和ΔlcsA中qRT-PCR的分析結(jié)果均表明：共20個基因（lcsA-lcsT）參與了leucinostatins的生物合成，基因簇中包括1個NRPS合成酶和兩個PKS合成酶，還包括一些修飾酶類，如O-甲基轉(zhuǎn)移酶lcsG、細(xì)胞色素P450、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、氨基轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、Acyl-CoA連接酶、tRNA合成酶等。
　　對脂肽類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶PKS（lcsC）、連接酶（lcsD）

9、和硫酯酶（lcsE）分別進(jìn)行了基因敲除，獲得了敲除突變體ΔlcsC,ΔlcsD和ΔlcsE。對野生型以及突變體菌株的發(fā)酵液粗提物進(jìn)行HPLC比較分析，發(fā)現(xiàn)在ΔlcsC,ΔlcsD和ΔlcsE的發(fā)酵液中，leucinostatin A和B是缺失的，其HPLC譜與ΔlcsA一致，確定了這幾個酶在leucinostatins生物合成過程中的關(guān)鍵作用。通過對lcs基因簇內(nèi)特異性轉(zhuǎn)錄因子lcsF的過表達(dá)，提高了leucinostatins的產(chǎn)量，

10、也確定了轉(zhuǎn)錄因子lcsF對于整個基因簇的調(diào)控作用。據(jù)此推導(dǎo)了leucinostatins的合成途徑：在PKS的催化作用下，乙酰CoA分子和丙二酸單酰CoA分子合成了短脂肪酸鏈4-甲基-六碳-2-烯酸；在連接酶（lcsD）和硫酯酶（lcsE）的催化作用下，4-甲基-六碳-2-烯酸連接到NRPS合成酶LcsA的第一個模塊的第一個結(jié)構(gòu)域上。LcsA具有10個模塊，能夠激活10個氨基酸，在C結(jié)構(gòu)域的催化下，這些氨基酸縮合為多肽鏈。LcsA C末

11、端的R結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)中間代謝產(chǎn)物多肽鏈的釋放。中間代謝產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)胺、羥基化以及不同程度的甲基化等修飾步驟后，最終形成了leucinostatin A和B。
　　野生型淡紫擬青霉（PLBJ-1）與馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）和辣椒疫霉病菌（P.capsici）進(jìn)行對峙培養(yǎng)，P.infestans和P.capsici菌落的生長受到抑制；leucinostatins缺失的ΔlcsA與P.infestans和

12、P. capsici對峙培養(yǎng)，這兩株卵菌生長的抑制作用消失；leucinostatins過表達(dá)的菌株OE:lcsF與卵菌對峙培養(yǎng)，抑制作用增強(qiáng)。這些結(jié)果說明了淡紫擬青霉能夠抑制卵菌的生長，這種抑制作用主要是由于leucinostatins的存在而產(chǎn)生的。
　　綜上所述，本研究對兩個淡紫擬青霉菌株進(jìn)行了基因組測序，通過與其他真菌的比較基因組分析，揭示了淡紫擬青霉的基因組特征。通過淡紫擬青霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對次級代謝產(chǎn)物相關(guān)基因進(jìn)行了