腫瘤微環(huán)境中IL-6-STAT3信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的作用.pdf

1、目的：
　　通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)，探討C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中IL-6/STAT3信號(hào)通路的過度激活和表達(dá)對(duì)于MSCs向腫瘤方向轉(zhuǎn)化的影響。為在腫瘤治療過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的安全使用及為避免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變藥物的探尋提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　本實(shí)驗(yàn)所需的腫瘤細(xì)胞即大鼠的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室兒科研究所腫瘤研究室（隸屬于重慶醫(yī)科大

2、學(xué)附屬兒童醫(yī)院）提供。
　　2.細(xì)胞來源
　　本次實(shí)驗(yàn)所需的Wistar大鼠和新生鼠（其中大鼠體重為40±10g且為無特殊病原體動(dòng)物SPF級(jí)別），均由大坪醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心（隸屬于第三軍醫(yī)大學(xué)）購(gòu)得，其合格證號(hào)為[SCXK（軍）2002-003]。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組和共培養(yǎng)3.1間接共培養(yǎng)體系的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)采用間接共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方式，其具體方法為把裝載或培養(yǎng)有C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞或星型膠質(zhì)細(xì)胞的transwell小室插入6孔板

3、中，進(jìn)而小室及其所載細(xì)胞便懸室6孔板中培養(yǎng)孔上，以便實(shí)驗(yàn)組的C6膠質(zhì)瘤外環(huán)境及其正常對(duì)照細(xì)胞星型膠質(zhì)細(xì)胞的外環(huán)境中的細(xì)胞因子及其它分泌性蛋白可透過小室濾過膜進(jìn)入其下方的6孔板的孔中，其相應(yīng)的細(xì)胞卻不能透過6孔板的孔中，而懸有小室的6孔板的孔中種植有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，這樣便達(dá)到了間接共培養(yǎng)的目的。將小孔上下兩種細(xì)胞的比例進(jìn)行調(diào)整，使其以上下相等的比例或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行間接共培養(yǎng)。
　　3.2實(shí)驗(yàn)分組本研究共分為4個(gè)組，分別設(shè)有實(shí)驗(yàn)組，陽(yáng)性

4、對(duì)照組，陰性對(duì)照組及空白組。其中將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與C6膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)組設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為陰性對(duì)照組，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)組設(shè)為空白組。
　　4.實(shí)驗(yàn)方法
　　4.1采用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4.2檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞周期的改變。
　　4.3采用RT-qPCR及WB檢測(cè)各組細(xì)胞STAT3，GP130，IL

5、-6R，MDM2及BCL-xl的表達(dá)情況。
　　4.4采用免疫熒光檢測(cè)STAT3和GP130的表達(dá)情況。
　　4.5將各組共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠被下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及采用HE染色檢查各組組織的瘤化情況，同時(shí)用免疫組化的方法檢測(cè)STAT3的表達(dá)情況。
　　4.6通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6及IL-6R的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過倒置相差顯微鏡的觀查，經(jīng)過共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的

6、生長(zhǎng)特點(diǎn)發(fā)生明顯改變，同時(shí)具有了C6膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)性能，在腫瘤微環(huán)境中培養(yǎng)3-4周之后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成長(zhǎng)梭狀生長(zhǎng)，且細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞更新明顯加快。
　　2.通過ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的IL-6及IL-6R時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)組的IL-6及IL-6R的表達(dá)明顯增多。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs增殖情況明顯增強(qiáng)。
　　4.通過激光共聚焦檢測(cè)到經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs細(xì)

7、胞其GP13P，STAT3及P-STAT3處于明顯高表達(dá)，與對(duì)照組比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.通過Western及PCR發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的骨髓間充干細(xì)胞中不僅STAT3表達(dá)增多，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)STAT3的下游相關(guān)蛋白也表達(dá)增多，如MDM2和CyclinD1。
　　6.將各組細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠體內(nèi)后其腫瘤增殖與對(duì)照組相比，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　MSCs的惡性轉(zhuǎn)變與S