NF-кB信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞治療燒傷膿毒癥的作用研究.pdf

1、燒傷膿毒癥的發(fā)生機(jī)制及治療方法一直是研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用,可通過(guò)旁分泌各種細(xì)胞因子或與各種免疫細(xì)胞相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用,用于炎癥性或免疫性疾病的治療。近年來(lái)已經(jīng)在 GVHD、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、急性腎功能損害、急性免疫性肝損傷等疾病,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞取得了明顯的治療效果,但是針對(duì)嚴(yán)重?zé)齻摱景Y的治療研究仍然甚少,且具體機(jī)制仍不十分清楚。
　　首先,建立一個(gè)有效的完全模擬膿

2、毒癥發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型及分離擴(kuò)增培養(yǎng)獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞非常關(guān)鍵。在第一部分實(shí)驗(yàn),以C57/BL6J小鼠10％III°燙傷創(chuàng)面,接種2×105 CFU銅綠假單胞菌建立小鼠燒傷膿毒癥模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:具有穩(wěn)定的膿毒癥發(fā)病率及死亡率,死亡率達(dá)50%-80%,;IL-1、IL-6、TNF-a及CRP等炎性因子明顯升高,IL-6最高達(dá)20ng/ml;心、肝、脾、肺及腎臟細(xì)菌含量增高,其中脾臟含量最高;各臟器炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥損傷嚴(yán)重,可見(jiàn)大量

3、的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血性滲出;ALT、AST、BUN、Cr持續(xù)升高,腎功及肝功能明顯下降。該實(shí)驗(yàn)表明該燒傷膿毒癥模型有較高的死亡率和可重復(fù)的穩(wěn)定性,并可進(jìn)一步可發(fā)展為SIRS和MODS;該模型較好的反應(yīng)了燒傷膿毒癥的病理機(jī)制及臨床特征。
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)采用酶消化、貼壁篩選以及差速離心法分離培養(yǎng)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞分析獲得90%以上的CD90、CD105、CD44表達(dá)陽(yáng)性,以及90%以上的CD34、CD45表達(dá)陰性的;

4、同時(shí)通過(guò)油紅O及堿性磷酸酶染色證明該細(xì)胞是有向成脂、成骨多向分化能力的脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)在膿毒癥模型制備6h后,運(yùn)用2×105脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療小鼠燒傷膿毒癥,觀察小鼠的一般狀況、生存率,檢測(cè)全身各臟器細(xì)菌及內(nèi)毒素定量、各臟器功能,以及促炎/抗炎因子的改變,明確脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在燒傷膿毒癥的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1、小鼠一般狀況、自主活動(dòng)及對(duì)外界的反應(yīng)都有明顯改善;2、小鼠24h、48h至72h臟

5、器的細(xì)菌含量明顯減少,而脾臟細(xì)菌定量變化最大,心臟的變化最小;3、隨時(shí)間延長(zhǎng),TNF-α、IL-12表達(dá)明顯下降及抗炎因子IL-10表達(dá)明顯升高,血清中TNF-α、IL-6等促炎癥因子及抗炎因子IL-10變化也是相同的。4、各臟器組織HE染色示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,肝小葉放射狀結(jié)構(gòu)保持完整;腎臟組織腎小管壞死細(xì)胞明顯減少,肺間質(zhì)增厚及肺泡內(nèi)的血性滲出明顯改善,肝、肺及腎臟組織細(xì)胞壞死凋亡明顯減少,臟器功能得到改善。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,脂肪

6、間充質(zhì)干細(xì)胞治療燒傷膿毒癥得到了肯定的療效。
　　在第四部分實(shí)驗(yàn)體外單獨(dú)或共培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與 Raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞,以探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及其NF-кB信號(hào)通路在干細(xì)胞治療膿毒癥可能的作用機(jī)制。將細(xì)胞分為四組:正常對(duì)照組、LPS刺激組、Transwell組、混合細(xì)胞組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:1、經(jīng) LPS刺激后,促炎因子 TNF-a、IL-6及抗炎因子TGF-b均有明顯升高,但隨時(shí)間延長(zhǎng),抗炎因子迅速下降,而促炎

7、因子持續(xù)升高;當(dāng)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),促炎因子明顯下降,抗炎因子明顯升高,其中促炎因子 TNF-a,及抗炎因子COX-2變化最明顯。2、經(jīng)LPS刺激24h后,CD206陽(yáng)性細(xì)胞增幅10%;隨時(shí)間延長(zhǎng),LPS刺激組CD206陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)明顯變化;但細(xì)胞Transwell及混合細(xì)胞共培養(yǎng)組,分別由23.3%增至38.5%,24.2%增至52.7%,較LPS刺激組有顯著的提高,且發(fā)現(xiàn),混合細(xì)胞組 CD206的細(xì)胞比例最高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、間充質(zhì)干細(xì)