芳香化酶抑制劑對(duì)體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細(xì)胞的影響.pdf

1、背景:子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs,簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是多發(fā)病,近年來發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì),其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,對(duì)策有限。故尋找相關(guān)病因是目前的研究熱點(diǎn)。近年來,關(guān)于芳香化酶(P450arom)研究較多,Matsuzaki等研究發(fā)現(xiàn):在EMs患者的在位和異位內(nèi)膜組織中發(fā)現(xiàn)芳香化酶異常表達(dá),而在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞中卻未發(fā)現(xiàn)芳香化酶的表達(dá)。說明P450arom在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,故芳香化酶抑制劑作為一種治

2、療EMs的新方法受到人們關(guān)注。近年來,由于倫理學(xué)問題,很難在人體進(jìn)行EMs的對(duì)照研究,尤其不可能隨機(jī)進(jìn)行各種類藥物的干預(yù)實(shí)驗(yàn)和刺激,芳香化酶抑制劑在EMs中的應(yīng)用研究轉(zhuǎn)向細(xì)胞模型,本研究利用體外培養(yǎng)絀胞模型來研究芳香化酶抑制劑來曲唑。進(jìn)一步證實(shí)來曲唑?qū)Ms的治療效果。此實(shí)驗(yàn)將有望為芳香化酶抑制劑治療EMs提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.通過對(duì)來曲唑作為芳香化酶抑制劑對(duì)體外培養(yǎng)EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞的影響探討來曲唑在

3、EMs治療中的作用。
　　 2.觀察來曲唑?qū)w外培養(yǎng)EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的最佳濃度和時(shí)間。
　　 3.電鏡下觀察正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞與體外培養(yǎng)EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的差別。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞。
　　 參照Ryna等的方法,略有改動(dòng)。
　　 2.應(yīng)用免疫組化法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。①基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白染色陽性,CK19染色陰性。陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,核為藍(lán)色

4、,陽性率為93％。②腺上皮細(xì)胞CK19染色陽性,波形蛋白染色陰性。陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,核為藍(lán)色,陽性率為90％。說明可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 3.電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。制備子宮內(nèi)膜細(xì)胞切片,在電鏡下觀察正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞與EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異。
　　 4.MTT法檢測(cè)不同濃度來曲唑抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖作用。將EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞隨機(jī)分為五組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,分別加入不同濃度來曲唑,即1×10-10mmol/L

5、,1×10-9mmol/L,1×10-8mmol/L,1×10-7mmol/L。以不加來曲唑組為陰性對(duì)照。分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后,MTT處理測(cè)定各孔492nm波長(zhǎng)吸收值,記錄結(jié)果。取OD平均值繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 5.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、增殖指數(shù)。將細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,24h后,用不同濃度來曲唑即1×10-10mmol/L,1×10-9mmol/L,1×10-8mmol/L,1×1

6、0-7mmol/L進(jìn)行刺激,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組,刺激時(shí)間為48h。達(dá)到預(yù)定時(shí)間后,收集細(xì)胞,采用PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每種刺激條件的樣本重復(fù)5次。
　　 結(jié)果:
　　 1.在電鏡下觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài)未發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞與EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞特異性差異。
　　 2.MTT結(jié)果顯示:24小時(shí)后,1×10-7mmol/L來曲唑組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各用藥組間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、>0.05)。48小時(shí)后,各用藥組與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示各濃度來曲唑在作用48小時(shí)后對(duì)體外培養(yǎng)EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞均有抑制增殖作用。來曲唑濃度為1×10-7mmoUL,時(shí)對(duì)EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞體外增殖抑制作用明顯高于1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。72小時(shí)后,各用藥組與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各藥物組間比較

8、(除1×10-8mmol/L與1×10-9mmol/L兩者比較),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示來曲唑?qū)Ms在位內(nèi)膜細(xì)胞體外增殖抑制作用隨濃度增大而增大,呈劑量依賴性。相同濃度來曲唑作用24小時(shí)與48小時(shí)兩者比較,高濃度組(1×10-7mmol/L、1×10-8mmol/L)有明顯抑制細(xì)胞增殖作用。低濃度組(1×10-9mmol/L、l×10-10mmol/L)兩時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作用72小時(shí)后,各濃度組抑制細(xì)胞增

9、殖作用與作用24h、48h比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示來曲唑抑制細(xì)胞增殖的作用需要一定時(shí)間,一定濃度,時(shí)間越長(zhǎng),作用越強(qiáng),濃度越大,作用越強(qiáng)。呈時(shí)間-濃度依賴性。濃度為1×10-7mmol/L來曲唑作用72h抑制作用最顯著。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):各用藥組與對(duì)照組相比,其細(xì)胞增殖指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示不同濃度來曲唑?qū)Ms在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖均有抑制作用。各用藥組間比較(除1×10-8

10、mmol/L與1×10-9mmol/L兩者比較),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明來曲唑?qū)Ms在位內(nèi)膜細(xì)胞抑制增殖作用呈劑量依賴關(guān)系,濃度越大,作用越強(qiáng)。
　　 來曲唑作用后的EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞分裂停滯在G0/G1期。
　　 與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞比較,EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖指數(shù)高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表示EMs在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性高于正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.來曲唑