基因槍介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染促進兔橈骨骨折愈合的實驗研究.pdf

1、目的：通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2，BMP-2）基因轉(zhuǎn)染以增加組織細胞BMP-2蛋白的分泌量，提高BMP-2蛋白在生物體骨折局部組織中的濃度，達到促進骨折愈合的目的已經(jīng)成為現(xiàn)實。但是，如何提高質(zhì)粒對于靶組織的轉(zhuǎn)染效率、尋求一種高效、簡便的轉(zhuǎn)染手段，如何縮短鑒定轉(zhuǎn)染是否成功的時間，以及在基因轉(zhuǎn)染促進骨愈合的過程中，采用不同的轉(zhuǎn)染時間、不同的轉(zhuǎn)染頻率和不同的轉(zhuǎn)染劑量與促進骨折愈合效果之間的

2、關(guān)系，一直未得到很好的闡明。本研究包括：1）建立穩(wěn)定的、基因序列正確的、檢測方便的、含有BMP-2基因的pIRES2-增強綠色熒光蛋白（enhance green fluorescent protein, EGFP）-BMP-2真核表達質(zhì)粒并檢測其轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞的效率及轉(zhuǎn)染后的生物學(xué)活性；2）從兔的股骨、脛骨中獲得骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)，培養(yǎng)、傳代后使用pIRES2

3、-EGFP-BMP-2質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，以了解該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的效率及轉(zhuǎn)染后的生物學(xué)活性；3）探討使用基因槍對兔橈骨骨折周圍組織進行pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、導(dǎo)入的有效性，并研究在不同時間、采用不同劑量、不同導(dǎo)入頻率進行基因槍介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染與兔橈骨骨折愈合之間的關(guān)系。
　　 方法：1）本課題第一部分：將BMP-2cDNA基因片段和pIRES2-EGFP載體兩種質(zhì)粒分別用EcoR I、BglⅡ作

4、雙酶切，采用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。擴增提取重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-BMP-2，純化處理后，用限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切、電泳鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司作測序鑒定。復(fù)蘇NIH3T3細胞，傳代、培養(yǎng)后采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)進行pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，轉(zhuǎn)染24小時后取部分細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。其余部分用含G418的

5、DMEM培養(yǎng)液篩選后搜集細胞，進行BMP-2蛋白的western blot檢測，對其轉(zhuǎn)染效果進行鑒定。2）本課題第二部分：采用取自2只新西蘭大白兔的新鮮股骨、脛骨標(biāo)本，剪除骨骺端后，穿刺骨髓、抽取骨髓經(jīng)離心后獲取單個核細胞，傳至第3代時進行Lipofectamine TM 2000介導(dǎo)的pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后取部分細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。其余部分用含G418的DMEM培養(yǎng)液進行篩選，4周后搜集

6、細胞，進行BMP-2蛋白的western blot檢測。3）本課題第三部分：采用健康新西蘭大白兔119只，隨機分為7組, 每組17只。采用耳緣靜脈麻醉后，手術(shù)區(qū)域剔除毛發(fā)，強力碘消毒、鋪無菌巾單，取左前臂背側(cè)3厘米切口逐層切開，采用微創(chuàng)顯露技術(shù)以盡量少干擾骨折周圍組織，直至切開骨膜，顯露橈骨中段，以線鋸造成橈骨中段的橫行骨折。所有動物模型制作均由同一位操作者完成。根據(jù)不同的組別施以干預(yù)措施。5μg組：手術(shù)造成骨折后立即給予5μg pIR

7、ES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織；10μg組：手術(shù)造成骨折后立即給予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織； 3天后10μg組：手術(shù)當(dāng)時僅造成骨折，然后關(guān)閉手術(shù)切口。3天后再次沿原手術(shù)切口切開顯露骨折部位，給予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織；3天后0μg組：手術(shù)當(dāng)時僅造成骨折，然后關(guān)閉手術(shù)切口。3天后再次沿原手術(shù)切口切開顯露骨折部位，給予10μg p

8、IRES2-EGFP空白質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織；14天后再次10μg組：本組大白兔在手術(shù)造成骨折后立即給予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織，14天后再次沿原手術(shù)切口顯露骨折，再給予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒的轟擊；14天后再次0μg組：本組大白兔在手術(shù)造成骨折后立即給予10μg pIRES2-EGFP- BMP-2質(zhì)粒轟擊骨折區(qū)及周圍組織，14天后再次沿原手術(shù)切口顯

9、露骨折，再給予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP空白質(zhì)粒的轟擊。對照組（0μg組）：手術(shù)造成骨折后立即給予不含BMP-2基因的10μg pIRES2-EGFP空白質(zhì)粒轟擊作為對照。各組于手術(shù)后1周時，隨機處死2只實驗動物，取骨折區(qū)周圍軟組織，行BMP-2蛋白的Western blot檢測, 觀察BMP-2蛋白表達情況。術(shù)后4、6、8和12周進行X光片攝片觀察骨折線變化、骨痂生長及骨髓腔再通情況，并在X光片提示骨折已經(jīng)愈合（骨折

10、線消失）時隨機處死該骨折愈合組中2只動物，進行大體標(biāo)本的觀察。
　　 結(jié)果：1）重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-BMP-2經(jīng)EcoRI\ BglⅡ雙酶切、電泳后，出現(xiàn)了1.2kbp和5.3kbp兩條帶，分別為BMP-2cDNA片段和pIRES2-EGFP載體片段，說明目的基因片段已連接到載體上；合成的質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)NCBI中的BLAST軟件分析，其核酸序列與Gene Bank中hBMP-2的mRNA序列(NM 001200)的編

11、碼序列相符，說明構(gòu)建質(zhì)粒的hBMP-2基因序列正確。經(jīng)pIRES2-EGFP-BMP-2轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察顯示增強綠色熒光蛋白陽性，Western blot檢測顯示在相對分子質(zhì)量(Mr)為30×103處顯現(xiàn)單一特異性條帶，證明有BMP-2蛋白的表達。2）從實驗動物兔股骨及脛骨中成功獲得了兔骨髓間充質(zhì)干細胞， LipofectamineTM2000介導(dǎo)的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓間

12、充質(zhì)干細胞24小時后，倒置熒光顯微鏡下顯示轉(zhuǎn)染后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)可見綠色熒光蛋白的持續(xù)表達，綠色熒光蛋白分布于整個細胞，呈胞漿分布。Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞在相對分子質(zhì)量(Mr)為30×103處顯現(xiàn)單一特異性條帶，說明有BMP-2蛋白的表達。3）經(jīng)基因槍介導(dǎo)pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的實驗動物，在骨折后7天，實驗動物骨折部位周圍軟組織的Western blot檢測顯示BMP-2蛋白

13、表達陽性，并且量明顯增多。實驗動物橈骨骨折愈合過程的X線4周、6周、8周、12周觀察顯示，5μg組、對照組（0μg組）較10μg組的骨折線消失時間延長、骨痂形成量差、骨髓腔再通時間延長；3天后10μg組與3天后0μg組相比，3天后10μg組骨折線消失時間縮短、骨痂形成量好、骨髓腔再通時間縮短：3天后10μg組與10μg組相比，在骨折線消失的時間、骨痂形成的質(zhì)量及骨髓腔再通的時間上無明顯差異；14天后再次10μg組與14天后再次0μg組相

14、比，在骨折線消失的時間、骨髓腔再通的時間上無明顯差異，但是在骨痂的形成質(zhì)量上優(yōu)于14天后再次0μg組及其他各組。
　　 結(jié)論：1）含有BMP-2基因序列的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功并具有轉(zhuǎn)錄活性。2）兔骨髓間充質(zhì)干細胞可被真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-BMP-2轉(zhuǎn)染并能在骨髓間充質(zhì)干細胞中翻譯、表達產(chǎn)生BMP-2蛋白。3）含有BMP-2基因的pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)?？梢员换驑尦晒?/p>

15、導(dǎo)入兔橈骨周圍的組織細胞中，并可在其內(nèi)翻譯、表達BMP-2蛋白。使用基因槍將BMP-2基因?qū)胪脴锕枪钦壑車M織以促進骨折愈合時，可以明顯縮短骨折的愈合時間、提高骨痂的生成質(zhì)量、縮短骨髓腔的再通時間。分別采用0μg、5μg、10μg pIRES2-EGFP-BMP-2質(zhì)粒導(dǎo)入促進骨折愈合時，在骨折愈合時間、骨痂生成量、骨髓腔再通時間上，隨導(dǎo)入質(zhì)粒劑量的增加而效果逐漸明顯。延遲于骨折當(dāng)時3天進行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2