葛根總黃酮體外誘導(dǎo)APL維甲酸敏感細(xì)胞株NB4凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的和意義]：
　　 葛根為江蘇省中醫(yī)院原創(chuàng)制劑“血復(fù)康”主要成分之一，臨床治療慢性粒細(xì)胞性白血病獲得了較好療效，在急性髓系白血病(acutemyelocyticLeukemia，AML)高白細(xì)胞癥的輔助治療也取得了一定療效。近五年來(lái)，課題組對(duì)葛根主要活性成分葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元處理不同AML細(xì)胞株的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)：葛根素及大豆甙元對(duì)相關(guān)AML細(xì)胞株的增殖影響微乎其微，而葛根總黃酮?jiǎng)t具有不同程度的增殖抑制作用；進(jìn)一步選

2、用Kasumi-1(AML-M2型細(xì)胞株，AML1/ETO)、HL-60(AML-M2型細(xì)胞株)、NB4和U937（AML-M5型細(xì)胞株）細(xì)胞株為研究對(duì)象，研究葛根總黃酮對(duì)不同AML細(xì)胞可能的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12.5～200μg/mlPRF體外對(duì)不同AML細(xì)胞株具有選擇性增殖抑制作用，以NB4細(xì)胞最強(qiáng)；可影響上述細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，阻滯細(xì)胞子S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明，上述劑量PRF可以延長(zhǎng)NB4細(xì)胞異種移植瘤裸鼠的生存周期

3、，抑制移植瘤瘤體的增長(zhǎng)。在此研究基礎(chǔ)上，本課題采用更低濃度PRF（0～50μg/ml），體外干預(yù)急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticLeukemia，APL)維甲酸敏感細(xì)胞株NB4，以期進(jìn)一步探討較低濃度PRF±ATO對(duì)NB4細(xì)胞增殖及凋亡的影響；借助維甲酸耐藥細(xì)胞株NB4-R1探討PRF±ATO干預(yù)NB4細(xì)胞與維甲酸受體可能的關(guān)系；PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡與MAPK及JNK相關(guān)信號(hào)通路的相關(guān)性和意義。
　

4、　 [實(shí)驗(yàn)方法]：
　　 1．實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組、0μg/mlPRF±1μMATO、10μg/mlPRF±1μMATO、30μg/mlPRF±1μMATO、50μg/mlPRF±1μMATO
　　 2．PRF±ATO作用NB4、NB4-R1細(xì)胞24、48、72h，MTT法檢測(cè)增殖抑制率；
　　 3．PRF±ATO作用NB4、NB4-R1細(xì)胞48h，瑞氏染色觀察NB4、NB4-Rl細(xì)胞形態(tài)學(xué)

5、變化，激光共聚焦顯微技術(shù)觀察NB4、NB4-R1細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)FITC-AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)NB4、NB4-R1細(xì)胞早期凋亡率改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NB4、NB4-R1細(xì)胞細(xì)胞周期改變；
　　 4．采用JNK抑制劑SP600125特異性抑制JNK1/2。分別以0μg/mlPRF±10μMSP600125、10μg/mlPRF±10μMSP600125、30μg/mlPRF±10μMSP600125、50μ

6、g/mlPRF±10μMSP600125處理NB4細(xì)胞48h，westernblotting檢測(cè)MAPK及JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)改變。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.10、30、50μg/mlPRF±1μMATO可有效抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病維甲酸敏感細(xì)胞株NB4及維甲酸耐藥細(xì)胞株NB4-R1增殖，呈濃度-時(shí)間依賴性(p＜0.05);ATO聯(lián)合處理組比PRF單藥組細(xì)胞凋亡更顯著，組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。1μMA

7、TO在以上時(shí)間段能有效抑制NB4細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間依賴性，而24、48h卻促進(jìn)NB4-R1細(xì)胞增殖。10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4細(xì)胞24、48、72h，IC50分別為39.82、27.45、19.27μg/ml，10、30、50μg/mlPRF+1μMATO聯(lián)合組IC50為29.30、21.08、7.56μg/ml;10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4-R1細(xì)胞，IC50分別為71.66、34.29、31.4

8、4μg/ml，10、30、50μg/mlPRF+1μMATO聯(lián)合組IC50為38.50、24.28、16.62μg/ml。
　　 2．瑞氏染色及激光共聚焦顯微技術(shù)見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本正常，PRF作用48h后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯凋亡特征。
　　 3.10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4細(xì)胞48h后，細(xì)胞早期凋亡率分別為6.6％、9.4%、10.7%，聯(lián)合1μMATO則分別為10.0%、10.8%、13.1%，聯(lián)合組較單

9、藥組顯著(p＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；NB4-R1細(xì)胞10、30、50μg/mlPRF單藥組，分別為7.14%，9.01%，11.38%，聯(lián)合組分別為8.18%、10.04%、14.59%。以上兩種細(xì)胞，單藥組及聯(lián)合組早期凋亡率均呈濃度依賴性增加(p＜0.05），聯(lián)合組較單藥組顯著p＜0.05）。
　　 4.PRF作用NB4、NB4-R1細(xì)胞48h后,30、50μg/mlPRF±ATO1μM組均出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞，隨著濃度增加

10、亞二倍體峰逐漸增高，S期細(xì)胞增多，提示PRF影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯于S期。
　　 5．隨著PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡增加，JNK1、JNK2/3、p38MAPK、ERK、TNFα表達(dá)上調(diào)；SP600125特異性抑制JNK1/2后，不同濃度PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞JNK1、JNK2/3、p38MAPK表達(dá)明顯受抑；ERK1/2、TNFα在50μg/mlPRF組表達(dá)下調(diào)，10、30μg/mlPRF組表達(dá)卻上調(diào)。
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