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文檔簡介
1、[目的和意義]:
葛根為江蘇省中醫(yī)院原創(chuàng)制劑“血復(fù)康”主要成分之一,臨床治療慢性粒細胞性白血病獲得了較好療效,在急性髓系白血病(acutemyelocyticLeukemia,AML)高白細胞癥的輔助治療也取得了一定療效。近五年來,課題組對葛根主要活性成分葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元處理不同AML細胞株的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn):葛根素及大豆甙元對相關(guān)AML細胞株的增殖影響微乎其微,而葛根總黃酮則具有不同程度的增殖抑制作用;進一步選
2、用Kasumi-1(AML-M2型細胞株,AML1/ETO)、HL-60(AML-M2型細胞株)、NB4和U937(AML-M5型細胞株)細胞株為研究對象,研究葛根總黃酮對不同AML細胞可能的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)12.5~200μg/mlPRF體外對不同AML細胞株具有選擇性增殖抑制作用,以NB4細胞最強;可影響上述細胞的細胞周期進程,阻滯細胞子S期,促進細胞凋亡。同時,體內(nèi)實驗也證明,上述劑量PRF可以延長NB4細胞異種移植瘤裸鼠的生存周期
3、,抑制移植瘤瘤體的增長。在此研究基礎(chǔ)上,本課題采用更低濃度PRF(0~50μg/ml),體外干預(yù)急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticLeukemia,APL)維甲酸敏感細胞株NB4,以期進一步探討較低濃度PRF±ATO對NB4細胞增殖及凋亡的影響;借助維甲酸耐藥細胞株NB4-R1探討PRF±ATO干預(yù)NB4細胞與維甲酸受體可能的關(guān)系;PRF誘導(dǎo)的NB4細胞凋亡與MAPK及JNK相關(guān)信號通路的相關(guān)性和意義。
4、 [實驗方法]:
1.實驗分組:空白對照組、DMSO溶劑對照組、0μg/mlPRF±1μMATO、10μg/mlPRF±1μMATO、30μg/mlPRF±1μMATO、50μg/mlPRF±1μMATO
2.PRF±ATO作用NB4、NB4-R1細胞24、48、72h,MTT法檢測增殖抑制率;
3.PRF±ATO作用NB4、NB4-R1細胞48h,瑞氏染色觀察NB4、NB4-Rl細胞形態(tài)學(xué)
5、變化,激光共聚焦顯微技術(shù)觀察NB4、NB4-R1細胞核形態(tài)學(xué)變化;流式細胞術(shù)FITC-AnnexinV/PI雙染法檢測NB4、NB4-R1細胞早期凋亡率改變;流式細胞術(shù)檢測NB4、NB4-R1細胞細胞周期改變;
4.采用JNK抑制劑SP600125特異性抑制JNK1/2。分別以0μg/mlPRF±10μMSP600125、10μg/mlPRF±10μMSP600125、30μg/mlPRF±10μMSP600125、50μ
6、g/mlPRF±10μMSP600125處理NB4細胞48h,westernblotting檢測MAPK及JNK通路相關(guān)蛋白表達改變。
[結(jié)果]:
1.10、30、50μg/mlPRF±1μMATO可有效抑制急性早幼粒細胞白血病維甲酸敏感細胞株NB4及維甲酸耐藥細胞株NB4-R1增殖,呈濃度-時間依賴性(p<0.05);ATO聯(lián)合處理組比PRF單藥組細胞凋亡更顯著,組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。1μMA
7、TO在以上時間段能有效抑制NB4細胞增殖,并呈時間依賴性,而24、48h卻促進NB4-R1細胞增殖。10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4細胞24、48、72h,IC50分別為39.82、27.45、19.27μg/ml,10、30、50μg/mlPRF+1μMATO聯(lián)合組IC50為29.30、21.08、7.56μg/ml;10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4-R1細胞,IC50分別為71.66、34.29、31.4
8、4μg/ml,10、30、50μg/mlPRF+1μMATO聯(lián)合組IC50為38.50、24.28、16.62μg/ml。
2.瑞氏染色及激光共聚焦顯微技術(shù)見對照組細胞形態(tài)基本正常,PRF作用48h后,細胞呈現(xiàn)明顯凋亡特征。
3.10、30、50μg/mlPRF單藥處理NB4細胞48h后,細胞早期凋亡率分別為6.6%、9.4%、10.7%,聯(lián)合1μMATO則分別為10.0%、10.8%、13.1%,聯(lián)合組較單
9、藥組顯著(p<0.05),具有統(tǒng)計學(xué)差異;NB4-R1細胞10、30、50μg/mlPRF單藥組,分別為7.14%,9.01%,11.38%,聯(lián)合組分別為8.18%、10.04%、14.59%。以上兩種細胞,單藥組及聯(lián)合組早期凋亡率均呈濃度依賴性增加(p<0.05),聯(lián)合組較單藥組顯著p<0.05)。
4.PRF作用NB4、NB4-R1細胞48h后,30、50μg/mlPRF±ATO1μM組均出現(xiàn)亞二倍體細胞,隨著濃度增加
10、亞二倍體峰逐漸增高,S期細胞增多,提示PRF影響細胞周期進程,使細胞阻滯于S期。
5.隨著PRF誘導(dǎo)的NB4細胞凋亡增加,JNK1、JNK2/3、p38MAPK、ERK、TNFα表達上調(diào);SP600125特異性抑制JNK1/2后,不同濃度PRF誘導(dǎo)的NB4細胞JNK1、JNK2/3、p38MAPK表達明顯受抑;ERK1/2、TNFα在50μg/mlPRF組表達下調(diào),10、30μg/mlPRF組表達卻上調(diào)。
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