5-FU可富集肺腺癌SPC-A1細胞系中腫瘤干細胞.pdf

1、目的:
　　 肺癌是對人類健康危害極大的惡性腫瘤，我國是肺癌發(fā)病率較高的地區(qū)，盡管目前我國肺癌的發(fā)病率有下降趨勢，但其發(fā)病率和死亡率仍高居惡性腫瘤首位。由于肺癌的發(fā)病機制不清，尚不能有效地預防其發(fā)生，因此探索肺癌發(fā)生的相關機制，尋找特異性的阻斷和治療方法一直是人們努力的方向。
　　 最近，大量實驗證實存在少量維持惡性生長的并具備自我更新能力的細胞亞群，這群細胞具備較高惡性程度的細胞被稱為腫瘤干細胞(cancer stem

2、 cell，CSC)或腫瘤起始細胞.目前已經(jīng)在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌等多種實體瘤中證實了CSC的存在．因此，根據(jù)此學說推測肺癌也可能來源于干細胞，是一種干細胞疾病。傳統(tǒng)治療方法雖然可使腫瘤體積明顯縮小，有的甚至可達到完全緩解，但實際上大部分腫瘤經(jīng)過一段時間的緩解期之后又會復發(fā)或轉移，這可能是由于現(xiàn)有的治療手段沒有清除這些決定復發(fā)和轉移的關鍵細胞——腫瘤干細胞的緣故。
　　 側群細胞(Side population cel

3、ls，SP)是Goodell在對造血干/祖細胞分離時發(fā)現(xiàn)的一群特殊干細胞.由于其細胞膜表面高表達ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette membrane tranon-sporter，ABC)，可將DNA染料Hoechst33342外排至細胞外，并且具備自我更新、多向分化、成瘤性等一系列干細胞的生物學特征。
　　 肺癌細胞對一些化療藥物具有耐藥性，且大部分耐藥細胞被5-FU阻滯于G0期，而研究表明，腫瘤干細胞大

4、多處于G0期。因此我們猜想，對5-FU表現(xiàn)出耐藥性的細胞群中是否可能包含了大量的腫瘤干細胞。我們能否利用這一耐藥模型來富集肺癌干細胞?本研究旨在探索5-FU對于肺腺癌細胞系SPC-A1中腫瘤干細胞的影響。
　　 方法:
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 肺腺癌SPC-A1細胞系購自ATCC。SPC-A1細胞在含有10％胎牛血清(GBICOInC.，NY，USA)的RPMI1640培養(yǎng)基(GBICOInc.，NY，USA)

5、和含有10％牛血清(GBICO Inc.，NY，USA)中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。
　　 2、四甲基偶氮哩鹽(tetrazolium，MTT)法檢測細胞增殖能力
　　 取對數(shù)生長期的肺癌細胞懸液進行細胞計數(shù)，分別接種于4個96孔板培養(yǎng)板。接種24小時后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時分別加入MTT(5mg/m1)20μl，繼續(xù)孵育4小時后，每孔加入150μlDMSO溶解結晶，測定各孔吸光度。

6、>　　 3、流式細胞儀檢測細胞周期
　　 收集對數(shù)生長期細胞制成1×106個/ml細胞懸液。75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制成500μL的細胞懸液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機檢測，ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。
　　 4、免疫熒光染色
　　 接種細胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2％的Triton-X100于常溫打孔15-30分鐘。1％的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后加入一抗

7、，4℃過夜。次日，加入相應二抗，室溫孵育1個小時后，DAPI染核，熒光顯微鏡觀察。
　　 5、Westernblot
　　 收集細胞，提取總蛋白，蛋白定量。電泳后將蛋白轉印到PVDF膜上，然后用3％小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2小時后ECL發(fā)光，曝光膠片后，測定灰度值
　　 6、FACS分選側群細胞
　　 37℃預熱的DMEM培養(yǎng)液（含2％FBS和10mmol/1 HEPES緩沖液）重懸

8、，計數(shù)，至細胞密度為1×106/ml;實驗分兩組：一組先加入Verapamil(50μg/m1)37℃，15min，再加入Hoechst33342熒光染料(5μg/m1)37℃反應90min;另一組直接加入Hoechst33342熒光染料(5μg/m1)37℃反應90min，洗滌并重懸，PI(2μg/ml)染死亡細胞；紫外光源流式細胞儀進行檢測及分選。
　　 7、Transwell基質膠細胞侵襲試驗
　　 用無血清的培養(yǎng)

9、基將Matrigel加入到孔徑為8.0μm的Tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細胞懸液(5×105cells/ml)，下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導劑，孵箱中孵育36小時后取出，用無菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經(jīng)固定、染色后封片，鏡檢10個高倍視野(400×)。
　　 8、克隆形成能力實驗
　　 將剛剛分選所得的SP和non-SP細胞分別接種于六孔扳，培養(yǎng)一周左右進行結晶紫染色計數(shù)形成的克

10、隆數(shù)（見圖）。克隆形成率(CloneFormation Efficiency，CFE)的計算公式為：CFE=克隆形成數(shù)／接種細胞數(shù)×100％。
　　 9、裸鼠致瘤實驗
　　 從SPC-A1細胞系中分選出的SP和non-SP細胞分別用RPMI.1640完全培養(yǎng)液重懸，計數(shù)，調整細胞濃度至5×104/ml，每個濃度接種3只BALB/c免疫缺陷小鼠，注射后每隔兩天觀察一次長瘤情況，注射后28天，斷頸處死。
　　 10、

11、統(tǒng)計分析
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行結果統(tǒng)計。所有以均數(shù)土標準差（X±SD）表示的數(shù)據(jù)，其實驗至少重復3次，P值＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、MTT結果提示：5-FU可抑制肺腺癌細胞SPC-A1增殖，不同濃度的5-FU作用于肺癌SPC-A1細胞后，細胞的生長有不同程度的抑制，這種抑制呈時間劑量依賴性，5-FU對肺癌SPC-A1細胞的半數(shù)抑制率(IC50)約為100μg/ml。

12、r>　　 2、細胞周期結果提示：IC50的5-FU作用于肺腺癌細胞系后，S期細胞比例從33.14％減少至18.20％，G0/G1期細胞比例從58.46％增加至76.68％。
　　 3、Westem-blot及免疫熒光結果提示：5-FU可增強SPC-A1細胞干細胞標記物的表達，在正常的肺腺癌SPC-A1細胞中Oct3/4，Sox2和ABCG2幾乎不表達，在5-FU半數(shù)抑制率(IC50)約為100μg/ml作用24h，48h后，S

13、PC-A1中Oct3/4，Sox2和ABCG2表達逐漸增強，三者表達趨勢接近一致。
　　 4、FACS結果提示：貼壁生長的SPC-A1細胞其SP細胞比例約為1.32％，5-FU分別作用24h，48h后，SP細胞比例顯著升高，分別達4.8％，8.0％。
　　 5、Transwell結果提示：SP細胞穿過基底膜的平均細胞數(shù)(60.75)遠遠多于轉染non-SP細胞(20.13)，這提示SP細胞具備較強侵襲能力，具備腫瘤干細胞

14、特性。SP細胞相對non-SP細胞具備較強侵襲能力。
　　 6、克隆形成能力計算所得SP細胞的CFE為40±2.3％，而non-SP細胞的CFE僅為14±1.2％，二者差異顯著(P＜0.05）。
　　 7、裸鼠致瘤實驗提示：SP細胞及non-SP細胞的致瘤能力存在顯著差異。相同數(shù)量的SP細胞在同一觀察時間點可以形成更大的腫瘤，且形成腫瘤的潛伏期較短。移植瘤組織經(jīng)石蠟包埋切片，HE染色檢查證實為腺癌。
　　 結論: