結(jié)核分枝桿菌保護性抗原的表達、純化及單克隆抗體的制備.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致的、以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。全球目前約有20億人感染了MTB，每年死于TB的人數(shù)高達200萬。TB已成為人類的頭號傳染病殺手。我國目前至少有5億人感染了MTB，每年死于TB的人數(shù)約有25萬，是我國其他傳染病和寄生蟲病死亡人數(shù)總和的兩倍多。卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)接種目

2、前仍然是預(yù)防TB的主要手段，但總體保護率不穩(wěn)定，介于0％-80％。TB目前仍沒有十分有效的早期診斷方法。隨著MTB耐藥株的出現(xiàn)與人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus HIV)合并感染及人口流動增加等因素的出現(xiàn)，進一步加劇了TB對人類的威脅。因此，積極研究MTB致病機制及免疫機制，研制更加有效的診斷及治療MTB感染的新方法、新技術(shù)、新疫苗就具有重大意義。
　　分泌蛋白是MTB在對數(shù)生長早期分泌到

3、菌體外的一類蛋白，也是目前確認的MTB蛋白中能夠誘發(fā)保護性免疫的一類蛋白，Ag85B和ESAT6是其中重要的組成成分，廣泛用于治療TB的預(yù)防和診斷研究中。復(fù)活促進因子（Resuscitation promoting factor，RPF）最早是在藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中發(fā)現(xiàn)的，它可以促進休眠期MTB的生長。RPFD以分泌形式表達，抗原性較強，因此，RPFD在TB的疫苗研制和快速診斷試劑方面有較大的應(yīng)用潛力。<

4、br>　　實驗?zāi)康模?br>　　構(gòu)建表達MTBH37RV保護性抗原Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-RPFD的原核表達載體，表達并純化三種蛋白，并制備抗Ag85B蛋白的單克隆抗體(mAb)。
　　實驗方法和結(jié)果：
　　1.以MTBH37RV株基因組為模版，采用PCR方法分別擴增ag85B,esat6，rpfD基因，經(jīng)測序證實與Genebank公布的序列完全一致。將目的基因片段亞克隆入pProEXHTb原核表達載

5、體，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pPro-ag85B、pPro-ag85B-esat6和pPro-esat6-rpfD。用IPTG誘導(dǎo)表達Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-RPFD三種蛋白。SDS-PAGE分析和Western Blot表明，成功地表達了Ag85B、Ag85B-ESAT6和ESAT6-RPFD蛋白。相對分子量分別為32kD，43kD和30kD，與預(yù)計蛋白大小相符。用Ni-NTA親和色譜柱變性條件下純化獲得三種重組蛋

6、白，200mL培養(yǎng)物可分別獲得25.52mg、17.16mg和23.76mg的純化蛋白，得率分別為4.4％、3％和4.1％。
　　2.取純化的Ag85B蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，乳化。6周齡雌性BAL/c小鼠100μg/只背部皮下多點注射。間隔2周，共免疫三次。末次免疫兩周后，選擇血清效價高的小鼠再經(jīng)腹腔加強免疫50μg/只。3天后取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)融合，加入鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板。用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)1周