GRIM-19對子宮頸癌細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞衰老的影響.pdf

1、研究背景
　　子宮頸癌是女性三大惡性腫瘤中最常見的,居后的是乳腺癌和直腸癌,它也是女性癌癥相關(guān)死亡的的主要原因。該病嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命,全世界每年大約有53萬新發(fā)的子宮頸癌病例,約有27萬女性死于子宮頸癌,其中80％左右發(fā)生在發(fā)展中國家。發(fā)病率最高的是南非,其次是亞洲。我國每年新發(fā)病例約13萬例,占全世界新發(fā)病例的近1/4。子宮頸癌的病因迄今尚未完全明確。研究表明90%以上的子宮頸癌伴有高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感

2、染,其中主要是16、18兩種亞型。高危型HPV持續(xù)感染在子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用,70%以上的子宮頸癌組織中存在著HR-HPV基因組的整合。
　　端粒是染色體末端形成的特殊帽子結(jié)構(gòu),使染色體不會隨著復(fù)制后的RNA引物的降解而縮短,也使染色體末端減少融合,從而維持著染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。隨著細(xì)胞的有絲分裂端粒也逐漸縮短,從而引起細(xì)胞的衰老和死亡,而端粒長度的維持靠端粒酶來不斷合成新的端粒序列。
　　端粒酶是一

3、種反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶,它以自身mRNA為模板在hTert的逆轉(zhuǎn)錄作用下進(jìn)行DNA的合成,加到染色體末端,維持端粒的長度。端粒酶結(jié)構(gòu)組成主要包括三部分:hTerc,hTert,Dyskerin。大多數(shù)體細(xì)胞中檢測不到端粒酶活性,而在高度增殖的細(xì)胞如干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、85%-95%的腫瘤細(xì)胞中可以檢測到端粒酶的表達(dá)。端?？s短和端粒酶的再激活在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著很重要的作用,一方面端?？s短可以引起染色體不穩(wěn)定和腫瘤的啟動,另一方面腫瘤的形

4、成需要端粒酶的再激活來穩(wěn)定端粒的消耗。端粒酶的活化與腫瘤的進(jìn)展、不良預(yù)后、復(fù)發(fā)的危險性密切相關(guān)。端粒長度的維持和端粒酶的活性與腫瘤細(xì)胞的永生化也密切相關(guān)。
　　GRIMs(genesassociatedwithretinoid-IFN-inducedmortality)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一群參與干擾素(interferon,IFN)和維甲酸(retinoicacid,RA)合并誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡基因,由Kalvakolanu,etal應(yīng)用

5、反義基因敲除的方法分離發(fā)現(xiàn)并首先報道的細(xì)胞凋亡蛋白。GRIM-19(geneassociatedwithretinoid-interferonmortality-19),是GRIMs家族的重要成員,是由IFN聯(lián)合RA誘導(dǎo)表達(dá)的一種細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子,定位于19p13.2,該區(qū)的多種基因為前列腺癌的抑制基因。GRIM-19編碼含144個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),分子量約16kd,其主要定位在線粒體,細(xì)胞核也有少量表達(dá),在人體多種正常組織中均有其表

6、達(dá)。GRIM-19參與細(xì)胞線粒體的呼吸作用,并參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控過程,其表達(dá)降低或位點的突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在某些腫瘤如腎癌、口腔癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺腫瘤等均發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達(dá)的降低。但GRIM-19在子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的具體作用目前尚不明確。
　　本課題組前期試驗已經(jīng)證實在子宮頸癌細(xì)胞株SiHa,HeLa和CaSki細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19可以上調(diào)p53及其下游基因p21的表達(dá),而在HPV

7、陰性的卵巢癌細(xì)胞株H08910細(xì)胞中卻并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。本實驗將以端粒酶為研究對象,進(jìn)一步探討GRIM-19對子宮頸癌細(xì)胞中端粒酶活性及細(xì)胞衰老的影響。
　　目的
　　研究子宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19對子宮頸癌細(xì)胞中端粒酶活性及細(xì)胞衰老的影響,為宮頸癌的生物治療提供新的理論依據(jù)和治療思路。
　　方法
　　(1)構(gòu)建GRIM-19真核表達(dá)質(zhì)粒:p3×Flag-GRIM-19(p3×Flag-CMV-Myc-24-GR

8、IM-19);(本課題組實驗室前期已構(gòu)建完成);(2)采用蛋白印跡法(WB)檢測GRIM-19對hTert,Dyskerin,P16及P21蛋白表達(dá)的影響;(3)細(xì)胞衰老試劑盒檢測GRIM-19對細(xì)胞衰老的影響;(4)采用免疫組化法方法檢測GRIM-19與Ki67蛋白表達(dá)影響;(5)采用Fish方法檢測GRIM-19對hTerc基因擴增的影響;(6)采用Elisa-Trap法檢測端粒酶活性;
　　結(jié)果：
　　(1)WB)檢測

9、結(jié)果顯示在宮頸癌細(xì)胞株HeLa與SiHa細(xì)胞中GRIM-19能降低hTert蛋白表達(dá),上調(diào)dyskerin,P16及P21蛋白表達(dá);(2)細(xì)胞衰老試劑盒檢測結(jié)果示GRIM-19增加細(xì)胞衰老;(3)免疫組化法方法檢測GRIM-19減少Ki67蛋白表達(dá);(4)Fish方法檢測GRIM-19對hTerc基因擴增無明顯作用;(5)Elisa-Trap法檢測結(jié)果顯示GRIM-19可以降低端粒酶活性。
　　結(jié)論
　　GRIM-19可以降