大腸桿菌合成左旋多巴及培養(yǎng)基優(yōu)化.pdf

1、帕金森病是一種錐體外系功能障礙引起的的慢性神經(jīng)退行性疾病?；颊叽竽X的黑質(zhì)與紋狀體的神經(jīng)細(xì)胞受損,導(dǎo)致產(chǎn)生多巴胺的酪氨酸羥化酶下降,造成大腦中多巴胺生成不足。目前常用的臨床治療帕金森病有效藥物是左旋多巴。本論文利用林可鏈霉素基因簇上的lmbB2基因構(gòu)建生產(chǎn)多巴的工程菌,優(yōu)化培養(yǎng)條件。并利用易錯(cuò)-PCR,試圖提高lmbB2基因表達(dá)產(chǎn)物的活性。
　　本文構(gòu)建了不同的重組質(zhì)粒,挑選出pCDFDuet-1為lmbB2基因表達(dá)的最優(yōu)表達(dá)載體,

2、并對(duì)lmbB2基因的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化,確定了在 IPTG誘導(dǎo)濃度為1mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為8h時(shí),酶的表達(dá)水平最好。建立了高效液相色譜檢測(cè)酪氨酸以及左旋多巴的條件,通過HPLC-MS檢測(cè)到了發(fā)酵樣品中確實(shí)有左旋多巴。
　　通過培養(yǎng)基的篩選,最終使用以甘油為碳源的M9培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。沒有經(jīng)過代謝改造的大腸桿菌中酪氨酸水平遠(yuǎn)不能滿足lmbB2基因產(chǎn)物的羥化速度,添加底物能增加發(fā)酵液中多巴的水平?？箟难岬奶砑幽軌蛎黠@提高酪氨酸的轉(zhuǎn)化率

3、,當(dāng)抗壞血酸的添加量3g/L,轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到92.5％。Fe2+,H2O2的添加對(duì)于基因的表達(dá)是有利的。
　　利用易錯(cuò)-PCR,構(gòu)建突變文庫,并建立了快速篩選的方法。通過高產(chǎn)菌的測(cè)序以及生物信息學(xué)分析lmbB2基因產(chǎn)物的輔酶可能是血紅素,催化活性位點(diǎn)可能是,96Gln,133Tyr,139Tyr,148Tyr,160His,170Asp,202His,238Tyr,239Asp,268Asp。
　　這本論文中所建立的工程菌