OMT對(duì)模擬高原缺氧大鼠腦線粒體呼吸氧耗與能量生成的影響及抗缺氧效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　 機(jī)體各組織和器官因缺氧而受到不同程度的損傷和功能低下，這是機(jī)體初次暴露在高原低氧環(huán)境下面臨的主要威脅，降低高原病的發(fā)生和提高機(jī)體在高原的生存及勞動(dòng)能力是高原醫(yī)學(xué)的重要課題。線粒體作為機(jī)體用氧的主要場(chǎng)所，其功能損害在缺氧性疾病的病理生理發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，而氧化磷酸化脫偶聯(lián)引起的用氧效率降低和能量生成減少是線粒體功能受損的主要特征。脫偶聯(lián)蛋白(Uncoupling Proteins，UCPs)所介導(dǎo)的質(zhì)子漏是導(dǎo)致氧化

2、磷酸化脫偶聯(lián)的重要機(jī)制。高原缺氧時(shí)線粒體UCPs活性和表達(dá)增加，脫偶聯(lián)程度增強(qiáng)，線粒體膜電位降低，ATP生成減少，從而導(dǎo)致機(jī)體功能和代謝障礙。中醫(yī)藥學(xué)博大精深，中藥具有廣泛應(yīng)用和開發(fā)前景，許多中藥已廣泛應(yīng)用于臨床。中藥單體結(jié)構(gòu)明確，成份單一，效果對(duì)應(yīng)，是理想的實(shí)驗(yàn)室研究對(duì)象。氧化苦參堿(Oxymatrane，OMT)是中草藥苦參中提取的有效生物堿，具有多種藥理作用。本實(shí)驗(yàn)利用中藥(單體)體外干預(yù)缺氧大鼠腦線粒體氧化磷酸化，從十余種中藥(

3、單體)中初步篩選出3種具有降低缺氧大鼠腦線粒體脫偶聯(lián)、改善呼吸氧耗的藥物，進(jìn)一步重點(diǎn)觀察了OMT在體外對(duì)缺氧大鼠腦線粒體能量生成及UCPs在其中的作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)而探討了OMT在體內(nèi)對(duì)小鼠的抗缺氧效應(yīng)，為高原病的防治和提高機(jī)體在高原的生存和勞動(dòng)能力提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為平原對(duì)照組和高原缺氧組，后者暴露于模擬海拔5000米高原低壓艙內(nèi)，23h/d，持續(xù)3d。分別在平原和模擬高原低

4、壓艙斷頭處死，分離大鼠腦線粒體。用不同濃度的12種中藥(單體)體外干預(yù)線粒體后，Clark氧電極法測(cè)定線粒體氧化呼吸活性，Rhodamine123法測(cè)定線粒體膜電位，初步篩選影響缺氧大鼠腦線粒體氧化呼吸的中藥(單體)。
　　 2.大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，正常干預(yù)組，缺氧對(duì)照組和缺氧干預(yù)組。分別建立腦組織及離體腦線粒體體外干預(yù)模型，經(jīng)2mmol/LOMT分別干預(yù)1h和5min，進(jìn)一步觀察OMT對(duì)缺氧大鼠腦線粒體氧化磷酸化的影響及U

5、CPs在其中的作用。Clark氧電極法測(cè)定線粒體氧化呼吸活性，Rhodamine123法測(cè)定線粒體膜電位，高壓液相色譜法分析腦組織線粒體內(nèi)腺苷酸含量，[3H]-GTP結(jié)合法測(cè)定腦組織UCPs的活性，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot分別測(cè)定UCP4、UCP5 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3.健康雄性昆明小鼠，利用常壓密閉缺氧模型，通過腹腔注射不同劑量的OMT或人參皂苷Rg1，觀察標(biāo)準(zhǔn)耐受時(shí)間，探討其抗缺氧能力及其

6、量效和時(shí)效關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過對(duì)12種中藥(單體)成份作用的觀察發(fā)現(xiàn)，OMT和人參皂苷Rg1均能通過降低缺氧大鼠腦線粒體ST4來提高氧化磷酸化效率，同時(shí)增加線粒體膜電位，且具有量效關(guān)系，1.5 mmol/L的OMT和人參皂苷Rg1分別能使缺氧大鼠腦線粒體RCR升高33.04%和34.25%，線粒體膜電位分別增加18.13%和16.15%(2mmol/L)。
　　 2.與正常對(duì)照組比較，缺氧對(duì)照組大

7、鼠腦線粒體UCPs活性和含量明顯升高，Kd值降低40.39%，Bmax提高105.26%，同時(shí)腦組織中UCP4和UCP5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)也明顯升高，其中UCP4和UCP5的mRNA量分別升高2.87倍和2.54倍，而蛋白表達(dá)量分別提高70.13%和116.67%；與缺氧對(duì)照組相比，缺氧干預(yù)組腦線粒體Kd提高44.08%，Bmax值降低20.90%，UCP4和UCP5 mRNA分別降低至0.46和0.48，且UCP4和UCP5蛋白表

8、達(dá)也顯著降低(34.35%和55.77%)。
　　 3.與正常對(duì)照組比較，缺氧對(duì)照組大鼠腦線粒體ST3、RCR和MMP顯著降低(分別降低18.44%、42.06%和18.78%)，而ST4則顯著升高(40.38%)；與缺氧對(duì)照組相比，2 mmol/L OMT體外干預(yù)可顯著改善線粒體氧化磷酸化效能，主要表現(xiàn)為ST4降低26.03%，RCR與MMP分別提高47.10%和18.13%。
　　 4.與正常對(duì)照組比較，缺氧對(duì)照組大

9、鼠腦線粒體ATP含量、ATP/ADP、能荷和ATP/總腺苷酸比值顯著降低，AMP和ADP含量顯著上升，其中ATP含量、ATP+ADP池、ATP/ADP、能荷以及ATP/總腺苷酸比值分別降低37.80%，24.59%，48.34%，29.79%和39.02%，AMP和ADP分別提高29.51%和18.51%；與缺氧對(duì)照組相比，2mmol/LOMT體外干預(yù)可顯著升高ATP含量、ATP/ADP、能荷和ATP/總腺苷酸比值，降低ADP含量，其中

10、ATP、ATP/ADP、能荷和ATP/總腺苷酸比值分別升高30.63%、120.47%，18.18%和36.00%，ADP降低40.56%。
　　 5.腹腔注射OMT可顯著延長(zhǎng)小鼠在密閉缺氧條件下的存活時(shí)間，且存在量效依賴關(guān)系。在最佳干預(yù)劑量(0.3 g/kg)時(shí)，OMT可提高小鼠標(biāo)準(zhǔn)耐受時(shí)間185.68%(13.83±3.17 vs39.51±9.03min/100mL)，注射1小時(shí)即可發(fā)揮最佳效果。
　　 結(jié)論：

11、r>　　 1.利用離體腦線粒體體外干預(yù)模型，從十余種中藥單體成份中初步篩選出OMT、人參皂苷Rg1和紅花黃色素可改善缺氧大鼠腦線粒體的氧化磷酸化效率，其中OMT和人參皂苷Rg1還可提高缺氧大鼠腦線粒體膜電位。
　　 2.OMT體外作用可顯著抑制缺氧引起的腦線粒體脫偶聯(lián)效應(yīng)，增加線粒體ATP生成，從而提高線粒體能量生成效率。其機(jī)制與OMT顯著抑制缺氧引起的腦線粒體UCPs活性增加和表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，提示UCPs為OMT的作用靶點(diǎn)之一