三種血小板生成關(guān)鍵因子共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個真核表達載體，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞，觀察三個真核表達載體在人骨髓基質(zhì)細胞中的表達情況。
　　 方法：
　　 1、分別對TPO、IL-6、IL-11三個基因片段克隆，再用PCR技術(shù)將克隆出來的TPO、IL-6、IL-11基因片段和pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)、pcDNA

2、3.1(-)這三個質(zhì)粒分別連接，構(gòu)建成TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個真核表達載體，并進行酶切鑒定及測序分析。
　　 2、用貼壁篩選法對人骨髓基質(zhì)細胞進行分離，選用分裂能力強的第三代細胞做為轉(zhuǎn)基因的靶細胞，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個真核表達載體共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞，并采用細胞免

3、疫組化及Western blot法等方法檢測多基因轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞后在mRNA和蛋白水平的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、酶切及測序結(jié)果證實，本實驗成功構(gòu)建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個真核表達載體。
　　 2、人骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)形態(tài)呈異質(zhì)性，原代細胞呈集落生長，傳代后則均勻生長。
　　 3、TPO-pEGFP-N1、IL-6-p

4、cDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個真核表達載體轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到TPO-pEGFP-N1的表達，25%細胞發(fā)出綠色熒光；免疫細胞化學染色檢測出IL-6及IL-11在細胞內(nèi)表達；經(jīng)Western blot檢測：TPO蛋白表達(TPO/GAPDH IOD比值)在正常對照組為(0.17±0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.18±0.01)，多基因轉(zhuǎn)染組為(0.62±0.01)；IL-6蛋白表達(I

5、L-6/GAPDH IOD比值)在正常對照組為(0.14±0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.18±0.04)，多基因轉(zhuǎn)染組為(0.34±0.06)；IL-11蛋白表達(IL-11/GAPDH IOD比值)在正常對照組為的(0.8±0.23)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.19±0.14)，多基因轉(zhuǎn)染組為(1.62±0.23)。多基因轉(zhuǎn)染組細胞的蛋白水平明顯高于對照組(P均<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過分子