海洋交替假單胞菌QY203的κ-卡拉膠酶研究.pdf

1、卡拉膠是由1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D.吡哺半乳糖作為基本骨架,交替連接而成的硫酸線性多糖。根據是否含有3,6-內醚半乳糖結構以及硫酸基的含量的不同,目前工業(yè)上生產和使用的卡拉膠主要為κ-型、τ-型和λ-型三種,其二糖單元分別含有1個、2個和3個硫酸基?？ɡz作為一種富含硫酸基的硫酸酯化多糖類物質,具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、降血脂、免疫調節(jié)和抗凝血等生物活性。
　　卡拉膠降解酶是一種糖水解酶,通過斷裂卡拉膠的β-1,

2、4糖苷鍵降解卡拉膠。卡拉膠降解酶的應用十分廣泛,在糖水解酶家族研究、卡拉膠的結構和功能解析、卡拉寡糖的工程化應用以及體內多糖代謝途徑研究等諸多方面具有重要的應用價值和理論研究意義。
　　本文通過富集培養(yǎng)等方法對海洋細菌進行篩選,得到了能夠降解κ-.卡拉膠活性的海洋細菌35株。以活性最高的QY203作為出發(fā)菌株進行了后續(xù)研究,通過對菌株QY203進行16S rDNA種屬鑒定和進化樹構建,將該菌株歸屬于海洋交替假單胞菌。
　　從

3、其發(fā)酵上清中利用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換層析等分離純化方法獲取了電泳純的K一卡拉膠酶(CgkP),從SDS-PAGE電泳結果中可知該酶分子量為34.0 kDa。分離純化CgkP回收率為26.9％,純酶的比活力高達1121.7 U/mg。利用純化出的CgkP進行酶學性質研究表明,該酶的最適反應溫度為45℃,最適反應pH為7.2。該酶在pH6.0-9.0時保持穩(wěn)定。該酶在45℃孵育1 h可保持80％的活性,在40℃孵育48 h可保存7

4、0％的活性。CgkP是一個具有良好溫度穩(wěn)定性的κ-卡拉膠酶。Na+能夠極大的促進酶的活性,K+對酶活性也有促進作用,而其他的金屬離子如:Ca2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+等以及SDS、EDTA對酶活性均有不同程度的抑制作用。
　　通過簡并PCR和反向PCR得到一個卡拉膠酶基因序列,將獲取的全長基因序列和氨基酸序列分別進行Blast比對,發(fā)現(xiàn)該序列與來源于Pseudoalteromonasgalactanivorans

5、 ATCC43555的κ-卡拉膠降解酶基因序列cgkA相似度最高為95％,Pseudoalteromonas tetraodonis中產的卡拉膠降解酶k142基因序列相似度為90％,氨基酸相似度分別為97％和95％。而將該基因進行歸屬時發(fā)現(xiàn)該基因序列與糖苷水解酶第16家族保守區(qū)相似度最高,因此我們將該卡拉膠酶CgkX歸類于第16家族。
　　酶解κ-卡拉膠獲取降解終產物,用P6柱分離純化,并且將純化的組分進行TLC分析,并用質譜法進

6、行鑒定,可知酶解后最終產物為硫酸新κ-卡拉二糖和硫酸新κ-卡拉四糖;用酶法降解不同時間之后底物粘度的變化和酶活性的變化關系確定了CgkP對κ-卡拉膠的降解方式為內切。
　　綜上所述,本文從青島膠州灣海域海泥中分離得到一株高效降解κ-卡拉膠的菌株Pseudoalteromonas sp.QY203,該菌株具有較高的活性和良好的遺傳穩(wěn)定性。通過對其發(fā)酵培養(yǎng),從其發(fā)酵上清中純化出了對κ-卡拉膠有專一性降解活性的κ-卡拉膠酶(CgkP),