骨髓間充質(zhì)干細胞在免疫性血小板減少癥發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、課題1:間充質(zhì)干細胞在慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥的作用研究
　　背景:原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一類由于自身免疫導致的血小板破壞增加、血小板生成受損的疾病。由于自身免疫耐受的打破，從而導致針對血小板以及巨核細胞的體液免疫和細胞免疫是慢性ITP的主要發(fā)病機制。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類能夠在自身免疫耐受中發(fā)揮免疫

2、調(diào)節(jié)功能的細胞群體，在多種自身免疫性疾病中有報道骨髓(BM)-MSCs的異常生物學特征和免疫學特性。
　　目的:本研究旨在比較研究慢性ITP患者BM-MSCs和正常對照BM-MSCs生物學特性及功能的差異，為探討慢性1TP患者BM-MSCs是否存在異常提供實驗基礎及理論依據(jù)，亦為慢性ITP的發(fā)病機制研究探討新思路。
　　方法:(1)采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法從慢性ITP患者和正常人骨髓組織中獲取相對純化的MSCs，除了采用普通

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)外，還設立了添加bFGF、EGF和ITS這三種額外添加物(addition supplements，AS);(2)倒置顯微鏡觀察BM-MSCs的形態(tài)特征;(3)流式細胞儀檢測培養(yǎng)的BM-MSCs表面標志;(4)定向誘導BM-MSCs向脂肪細胞和成骨細胞分化，進行相應染色，比較成脂、成骨的分化潛能;(5)測定BM-MSCs增殖能力并繪制生長曲線;(6)流式細胞儀方法檢測BM-MSCs細胞周期及細胞凋亡;(7)建立BM-MSCs與

4、外周單個核細胞(PBMCs)共培養(yǎng)體系，比較研究BM-MSCs對PHA活化的PBMCs細胞的增殖、分泌TNF-α、IFN-γ和IL-10的影響;(8)建立BM-MSCs與CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)體系，研究BM-MSCs對CD4+T細胞向CD4+CD25+CD1271ow調(diào)節(jié)性T細胞的分化的能力。
　　結果:(1)成功培養(yǎng)并獲取高純度的慢性ITP患者骨髓間充質(zhì)干細胞;(2)采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，慢性ITP患者BM-MSCs與正常BM-

5、MSCs存在形態(tài)學差異，正常BM-MSCs細胞體積小、纖細、呈長梭形，規(guī)則排列生長;ITP患者BM-MSCs細胞扁平且體積較大，呈短梭形、多角形、不規(guī)則形，邊緣不整齊。AS能夠改善ITP患者BM-MSCs形態(tài)異常，與正常BM-MSCs無明顯差別。(3) ITP患者BM-MSCs與正常對照BM-MSCs均表達CD73、CD105和CD90，均不表達造血細
　　胞標志CD34、CD45，不表達CD11b、CD14和CD19。(4) I

6、TP患者BM-MSCs分化為脂肪細胞和成骨細胞能力與正常BM-MSCs相比未見明顯差異。(5) ITP患者BM-MSCs細胞凋亡水平明顯高于正常對照。AS處理能夠減少BM-MSCs的凋亡水平，此時ITP患者同正常對照無明顯差異。(7) ITP患者BM-MSCs以劑量依賴的方式抑制正常來源PBMCs增殖，但與正常BM-MSCs相比能力下降。ITP患者BM-MSCs抑制PBMCs對IFN-γ、 TNF-α的分泌，但是促進PBMCs分泌IL-

7、10的能力相比正常BM-MSCs下降。(8) ITP患者BM-MSCs誘導正常來源CD4+T細胞分化為Treg的能力與正常BM-MSCs相比降低。
　　結論:慢性ITP患者來源的BM-MSCs增殖能力受損，形態(tài)異常以及過度凋亡，而這些缺陷可以被改良的培養(yǎng)條件矯正。慢性ITP患者BM-MSCs與正常來源的BM-MSCs相比有著相同的免疫表型和相似的分化成骨成脂能力。然而慢性ITP患者來源的BM-MSCs的免疫抑制功能和誘導Tregs

8、的能力相比正常來源的BM-MSCs明顯下降。這些研究發(fā)現(xiàn)提示了慢性ITP患者BM-MSCs存在一定缺陷，可能與慢性ITP的發(fā)病相關。
　　課題二:白細胞介素-7在慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥中的作用研究
　　背景:原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種器官特異性的自身免疫性疾病，伴隨多種免疫異常，包括自身反應性淋巴細胞的過度增殖和凋亡抵抗。白介素7(Interl

9、eukin-7，IL-7)是由非骨髓來源的間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，能夠維持靜息CD4+T細胞和CD8+T細胞穩(wěn)態(tài)的一類重要細胞因子，在T細胞清除時血漿以及組織中的IL-7水平會明顯升高。而且IL-7也能夠維持未成熟B細胞的存活并在免疫球蛋白的產(chǎn)生中具有重要作用。
　　目的:本實驗主要目的是想確定IL-7對ITP患者外周單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)和骨髓單個核細胞(bo

10、ne marrow mononuclear cells，BMNCs)的作用。
　　方法:(1)通過ELISA方法檢測血漿及細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的表達;(2)通過流式細胞術檢測CD4+細胞表面IL-7α的表達;(3)通過BrdU摻入的方法檢測IL-7對PBMCs和BMNCs細胞增殖的作用;(4)通過流式細胞術檢測IL-7對血小板、PBMCs和BMNCs的凋亡影響。
　　結果:通過ELISA檢測，我們發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血血漿I

11、L-7水平低于正常對照，與是否用藥無關，與患者血小板水平正相關;疾病緩解后IL-7表達升高但仍然低于正常對照。骨髓血漿中IL-7在ITP與患者之間并沒有明顯區(qū)別。ITP患者和正常對照CD4+T細胞表面IL-7Rα表達水平?jīng)]有差異。體外刺激實驗顯示IL-7上調(diào)了ITP患者自體血小板的凋亡，促進外周以及骨髓單個核細胞的增殖，促進了IFN-γ TNF-α和IL-10的分泌，抑制CD8+T淋巴細胞的凋亡。
　　結論:ITP患者體內(nèi)IL-7