模式生物——秀麗隱桿線蟲表達(dá)系統(tǒng)的建立.pdf

1、秀麗隱桿線蟲學(xué)名為Caenorhabditis elegans，簡稱C.elegans，屬于線形動(dòng)物門、線蟲綱動(dòng)物。秀麗隱桿線蟲本身在自然狀態(tài)下與人類的關(guān)系不大，它生活在世界各地的泥土中，以細(xì)菌為食，容易人工養(yǎng)殖，對人、動(dòng)物和植物沒有危害。秀麗隱桿線蟲成蟲長1mm左右，全身透明，研究者很容易在顯微鏡下對其細(xì)胞和組織進(jìn)行跟蹤觀察。秀麗隱桿線蟲作為一種模式生物，已廣泛應(yīng)用于寄生性線蟲基因功能的研究以及寄生性線蟲疫苗候選抗原基因的表達(dá)，但在我

2、國這方面的研究起步相對較晚。本研究通過秀麗隱桿線蟲體培養(yǎng)特性、Actin—1啟動(dòng)子基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，建立秀麗隱桿線蟲表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步表達(dá)寄生蟲抗原提供良好的技術(shù)平臺。
　　 本實(shí)驗(yàn)對秀麗隱桿線蟲形態(tài)、培養(yǎng)條件以及保存方面進(jìn)行了研究。將同量秀麗隱桿線蟲分別接種于涂有大腸桿菌(OP50)的NGM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、LB+膽固醇培養(yǎng)基上，16℃培養(yǎng)72h后，肉眼可見有大量蟲體在NGM培養(yǎng)基表面蠕

3、動(dòng)，鏡檢有大量大小不同的幼蟲，說明NGM培養(yǎng)基比較適合蟲體生長。
　　 把同量秀麗隱桿線蟲接種于涂有大腸桿菌(OP50)NGM培養(yǎng)基中，分別置4℃、16℃和37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察蟲體的生長發(fā)育情況，結(jié)果表明，16℃培養(yǎng)條件下蟲體生長發(fā)育良好，可見大量成蟲和幼蟲。同時(shí)把秀麗隱桿線蟲蟲卵接種于涂有大腸桿菌(OP50)NGM培養(yǎng)基中，置16℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察蟲體的生長發(fā)育情況；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3天后觀察到有蟲體孵化出

4、來，蟲體大小相近且生長良好，這樣可以獲得符合試驗(yàn)要求的同期蟲體。
　　 將欲保存的蟲體分別置于10％的二甲基亞砜、10％的甘油(S緩沖液溶解)、30％的甘油(S緩沖液溶解)、不加任何物質(zhì)直接放入—80℃凍存，保存兩個(gè)月后取出蟲體，解凍后鏡檢和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，30％甘油溶液—80℃冰箱中保存蟲體是比較方便可行的保存方法。
　　 把培養(yǎng)的蟲體置普通顯微鏡下觀察，雌雄同體成蟲長1mm左右，它通身透明，頭部較粗尾端較細(xì)，在固體培養(yǎng)基表

5、面蠕動(dòng)緩慢，但在液體中運(yùn)動(dòng)較快。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蟲體腸道部位可發(fā)出自發(fā)性熒光，且隨著蟲齡的增加自發(fā)性熒光由黃綠色變?yōu)辄S色。
　　 為獲取秀麗隱桿線蟲特異性表達(dá)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，我們參照己發(fā)表的秀麗隱桿線蟲Act—1基因序列設(shè)計(jì)引物，以秀麗隱桿線蟲基因絹DNA為模板.進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的特異性DNA條帶長度略小于300 bp。將PCR產(chǎn)物與pUCm—T載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆

6、。對質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ、HindⅢ雙酶切和PCR鑒定，對鑒定正確的克隆進(jìn)行測序。序列分析表明，Act—1啟動(dòng)子基因其序列高度保守，與Genebank報(bào)道的序列一致，且包含真核細(xì)胞基因啟動(dòng)子的一些分散的保守序列，如TATA框、GATA框、CACCC框、AP1、CAAT框和多個(gè)GC框等，其中CAAT框和GC框均屬于上游控制元件，但沒有發(fā)現(xiàn)在原核生物中比較常見的—35序列、SP1等重要序列。
　　 為了實(shí)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲肌動(dòng)蛋白(Act—

7、1)啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因在特定組織中特異性表達(dá)，pEGFP—N1真核表達(dá)載體經(jīng)AseⅠ和NheⅠ雙酶切去掉CMV啟動(dòng)子序列，補(bǔ)平自連成載體pEGFP—4.1(4.1kb)。利用PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)的HindⅢ酶切位點(diǎn)和T載體多克隆位點(diǎn)中的XhoⅠ，將秀麗隱桿線蟲的Act—1啟動(dòng)子序列克隆入同樣經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ作用后的pEGFP—4.1載體上。所構(gòu)建的載體命名為pAct—EGFP，總長約為4.4kb。連接篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定。同

8、時(shí)，我們利用雙酶切方式將Act—1啟動(dòng)子序列克隆入同樣經(jīng)過雙酶切作用后的pEGFP—N1載體上，構(gòu)建了含CMV和Act—1的雙啟動(dòng)子真核表達(dá)載體pCMV—Act—EGFP。
　　 為了探討單啟動(dòng)子和雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在秀麗隱桿線蟲中的GFP表達(dá)效果，將上述構(gòu)建好的兩種高濃度質(zhì)粒與秀麗隱桿線蟲混勻后浸泡，即采用RNAi by soaking的方法，同時(shí)設(shè)立對照，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48h試驗(yàn)組蟲體有特異性綠色熒光且亮度

9、較強(qiáng)，表明有GFP的表達(dá)；培養(yǎng)72h后蟲體熒光亮度仍然很亮。GFP主要集中在蟲體的皮層、副皮層中，蟲體前端尤為明顯。與單啟動(dòng)子比較，發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)啟動(dòng)子元件的試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度更強(qiáng)一些，說明采用雙啟動(dòng)子可以提高目的基因的表達(dá)效率。
　　 為了比較不同轉(zhuǎn)化方式對秀麗隱桿線蟲表達(dá)EGFP的影響，將pBluescriptSK+表達(dá)載體和pcDNA—EGFP載體上的EGFP序列分別經(jīng)Bam HI和NotⅠ雙酶切，連接篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒

10、定構(gòu)成pB—EGFP表達(dá)載體。pB—EGFP表達(dá)載體和T載體上的Act—1啟動(dòng)子序列分別經(jīng)PstⅠ和SalⅠ雙酶切，連接篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切鑒定正確后構(gòu)建成pB—Act—EGFP真核表達(dá)載體。將該載體通過兩種方式導(dǎo)入蟲體：一為電轉(zhuǎn)化至沙門氏菌中，通過減毒沙門氏菌攜帶該載體侵染秀麗隱桿線蟲；另一為通過電穿孔法來進(jìn)行表達(dá)。
　　 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩組蟲體培養(yǎng)24h后綠色熒光亮度較弱，培養(yǎng)48h蟲體特異性綠色熒光亮度較強(qiáng).表明有