自身免疫性糖尿病患者NK細胞關鍵受體與配體基因及其表達的探討.pdf

1、第一部分湖南漢族人群NK細胞受體KIR及其配體HLA-C基因多態(tài)性分析
　　 目的:探討湖南漢族人群殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因的多態(tài)性、單倍型和基因型及其配體HLA-C基因多態(tài)性、KIR/HLA-C基因組合的特點,為進一步研究KIR基因在疾病和移植免疫中的作用提供基礎數(shù)據(jù)。
　　 設計:橫斷面研究。方法:采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術,檢測429例湖南漢族健康志愿者KIR基因和HLA-C基因的分布頻率,并分析KI

2、R基因的單倍型、基因型和KIR/HLA-C基因組合特點。
　　 結果:(1)在湖南漢族人群中共檢出16種KIR基因,其中框架基因KIR2DL4、3DL2、3DL3和3DP1頻率為100％；KIR2DL1、2DL3、3DL1、2DS4、2DP1基因較為常見,頻率均＞90％,KIR2DS1、2DL5、3DS1、2DL2、2DS2、2DS3、2DS5頻率均＜40％；(2)湖南漢族人群KIR基因頻率分布與日本人相似,而KIR2DL2、2

3、DS2、2DS3和2DL5頻率低于高加索人群,KIR2DL3頻率高于高加索人群；(3)湖南漢族人群KIR基因以A單倍型為主,A、B單倍型頻率分別為69.6％、30.4％,比例約為2:1；(4)在湖南漢族人群中共發(fā)現(xiàn)49種KIR基因型,其中4種未見報道；KIR基因型以AA型最為常見(44.5％)；(5)湖南漢族人群HLA-C基因以HLA-C1為主,頻率高達98.1％；(6)湖南漢族人群KIR2D/HLA-C基因組合以HLA-C1(+)/H

4、LA-C2(-),KIR2D1(+)/2DL2(-)/2DL3(+)/2DS1(-)/2DS2(-)最為常見(23.9％)。
　　 結論:湖南漢族人群具有獨特的KIR基因型,豐富的KIR、HLA-C基因多態(tài)性和KIR/HLA-C基因組合方式。
　　 第二部分自身免疫性糖尿病患者NK細胞受體KIR及其配體HLA-C基因多態(tài)性分析
　　 目的:探討KIR和HLA-C基因多態(tài)性與自身免疫性糖尿病的關系。
　　

5、設計:橫斷面、病例對照研究。
　　 方法:采用聚合酶鏈反應.序列特異性引物技術(polymerase chainreaction-sequence specific primer,PCR-SSP),檢測387例湖南漢族自身免疫性糖尿病患者[180例急性起病自身免疫性糖尿病(T1ADM)患者和207例成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)患者]和性別、年齡、區(qū)域匹配的429例正常對照者(199例對照A組和230例對照組B)KIR基

6、因和HLA-C基因的多態(tài)性,分析其與自身免疫性糖尿病遺傳易感的關系。
　　 結果:(1)與相應的正常對照組比較,T1ADM組KIR2DL1(98.9％vs.92.0％,OR=7.781,P＜0.01)、3DL1(94.5％ vs.86.4％,OR=2.669,P＜0.01)和2DS4(83.9％ vs.70.9％,OR=2.142,P＜0.01)頻率增高；LADA組KIR2DL3(99.5％ vs.96.1％,OR=8.389,

7、P＜0.05)頻率增高；KIR基因在湖南漢族自身免疫性糖尿病患者中的遺傳易感性與其他種族的不同；(2)激活性KIR基因的總個數(shù)在T1ADM組高于其正常對照A組(2.02 vs.1.78,P＜0.05)；(3)KIR基因A、B單倍型在T1ADM組分別為69.7％、30.3％,在LADA組分別為75.4％、24.6％；A、B單倍型比例分別約為2:1,3:1；(4)T1ADM組、LADA組與相應的正常對照組比較,HLA-C(HLA-C1、HL

8、A-C2)基因頻率無差異；(5)與相應的正常對照組比較KIR/HLA-C基因組合,T1ADM組KIR2DL1(-)/HLA-C2(-)(0.6％ vs.6.0％,OR=0.087,P＜0.01)、LADA組KIR2DL3(-)/HLA-C1(+)(0.5％vs.3.9％,OR=0.119,P＜0.05)頻率降低；(6)與正常對照A組比較KIR2D/HLA-C基因組合方式,T1ADM組HLA-C1(+)/HLA-C2(-),KIR2DL1

9、(+)/2DL2(-)/2DL3(+)/2DS1(+)/2DS2(-)頻率升高(24.4％ vs.15.6％,OR=1.753,P＜0.05)。
　　 結論:KIR基因多態(tài)性和KIR/HLA-C基因組合與自身免疫性糖尿病發(fā)病相關。
　　 第三部分急性起病自身免疫性糖尿病患者KIR基因與HLA-DQ、MICA基因的相互作用
　　 目的:分析急性起病自身免疫性糖尿病(T1ADM)患者KIR基因與HLA-DQ或MICA

10、基因的相互作用。
　　 設計:橫斷面、病例對照研究。
　　 方法:采用PCR-直接測序法(PCR-Sequencing Based Typing,PCR-SBT)對湖南漢族180例T1ADM患者和199例正常對照者的DNA樣本進行HLA-DQ和MICA基因多態(tài)性檢測,并分析T1ADM的HLA-DQ和MICA易感等位基因、單倍型或基因型。采用Svejgaard& Ryder檢驗分析KIR易感基因(KIR2DL1、3DL1或

11、2DS4)與HLA-DQ易感單倍型或MICA易感等位基因在T1ADM中的相互作用。
　　 結果:(1)湖南漢族T1ADM患者HLA-DQ易感等位基因為DQA1*03、DQA1*0501/0503、DQB1*0201、DQB1*0303和DQB1*0401；保護性等位基因為DQA1*0101/0104、DQA1*0102、DQA1*0103、DO A1*0601、DQB1*0301、DQB1*0502、DQB1*0601和DQB1

12、*0602；易感單倍型為DQA1*03-DQB1*0303、DQA1*03-DQB1*0401、DQA1*05-DQB1*0201；保護性單倍型為DQA1*0601-DQB1*0301、DQA1*0102-DQB1*0601、DQA1*0102-DQB1*0602；(2)湖南漢族T1ADM患者MICA易感等位基因為MICA9,保護性等位基因為MICA5.1；MICA易感基因型為MICA4/9和MICA9/9:(3)同時攜帶KIR易感基因

13、(KIR2DL1、3DL1或2DS4)和HLA-DQ易感單倍型或MICA9等位基因者T1ADM發(fā)病風險升高(OR=1.077～21.111)；(4)HLA-DQ易感單倍型或MICA9等位基因在攜帶KIR2DL1或KIR3DL1基因者中增加T1ADM發(fā)病風險(OR=2.929～7.222)；(5)HLA-DQ易感性單倍型對T1ADM的易感性強于KIR2DS4(OR=3.750)；(6)KIR3DL1或KIR2DS4基因在不攜帶MICA9等

14、位基因者中可增加T1ADM發(fā)病風險(OR=3.792或2.424)。
　　 結論: KIR基因可協(xié)同增強HLA-DQ和MICA基因對T1ADM遺傳易感性。
　　 第四部分自身免疫性糖尿病患者NK細胞及其受體KIR和NKG2D的變化
　　 目的:觀察自身免疫性糖尿病患者NK細胞及其表面受體的變化,探討NK細胞在自身免疫性糖尿病發(fā)病機制中的作用,為自身免疫性糖尿病的預測、病情監(jiān)測和治療提供思路和手段。
　　

15、設計:橫斷面、病例對照研究。
　　 方法:選擇我院內分泌科收治的53例自身免疫性糖尿病患者(35例T1ADM患者和18例LADA患者),健康體查篩選的28例正常對照者,采用流式細胞儀技術檢測T細胞亞群、NK細胞的比例和NK細胞表面受體(KIR和NKG2D)的表達,采用MTT方法檢測IL-2孵育前后NK細胞的活性,比較、分析自身免疫性糖尿病患者NK細胞數(shù)目和活性及其表面受體表達的變化。
　　 結果:(1)與相應的正常對照組

16、比較,T1ADM組CD3+T細胞比例升高(70.5％ vs.64.6％,P＜0.05),NK細胞比例下降(13.8％vs.20.1％,P＜0.01)；(2)T1ADM組和LADA組NK細胞活性低于相應的正常對照組(30.9％ vs.47.1％,P＜0.01；39.8％ vs.49.2％,P＜0.05),與相應的LADA組及其亞組比較,T1ADM組(30.9％ vs.39.8％,P＜0.01)、新發(fā)(33.2％ vs.40.9％,P＜0.

17、05)和長病程T1ADM組(28.1％ vs.38.6％,P＜0.05)NK細胞活性降低；(3)IL-2孵育后T1ADM組和LADA組NK細胞活性均增強(43.2％ vs.30.9％,47.4％vs.39.8％,P＜0.05)；T1ADM組和其新發(fā)組NK活性的增長差值分別大于LADA組和LADA新發(fā)組(9.9％ vs.7.4％,P＜0.05；12.9％vs.8.0％,P＜0.05)；(4)與正常對照A組比較,T1ADM組KIR2DL1(

18、10.2％ vs.6.2％,P＜0.05)和NKG2D(96.9％ vs.95.2％,P＜0.05)表達升高。
　　 結論:(1)自身免疫性糖尿病患者外周血中CD3+T細胞比例升高,NK細胞的比例和活性下降,其中T1ADM患者較LADA患者存在更嚴重的NK細胞免疫異常；(2)IL-2可改善自身免疫性糖尿病患者NK細胞的活性,且其對早期T1ADM患者的改善能力高于LADA患者；(3)T1ADM患者NK細胞表面受體KIR2DL1和N