RNA干擾沉默食管癌細胞MMP-2基因的實驗研究.pdf

1、背景及目的：食管癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其治療效果不佳的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此針對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因研究成為腫瘤研究的熱點之一?；|(zhì)金屬蛋白酶-2是降解細胞外基質(zhì)和基底膜的重要酶，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中有較高的表達。RNA干擾技術(shù)是近年來產(chǎn)生的新興生物技術(shù)，可特異性地導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解，從而阻斷特定基因的表達。利用RNA干擾特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達，使

2、這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療腫瘤。我們采用RNA干擾的技術(shù)，特異性抑制食管癌細胞MMP-2基因的表達，觀察食管癌細胞遷移和侵襲能力的變化，并使用基因芯片技術(shù)檢測MMP-2表達下調(diào)前后食管癌細胞基因表達譜的差異。以期進一步研究食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移機制，探討控制食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的策略以及探索食管癌基因治療的靶點。 方法： 1．對4種食管癌細胞系EC9706、KYSE510、KYSE150、TE1

3、3進行常規(guī)培養(yǎng)，采用熒光定量PCR和Western blot方法對食管癌細胞MMP-2基因在mRNA和蛋白水平的表達進行檢測，分析其表達豐度與食管癌細胞惡性程度的關(guān)系，同時篩選出高表達MMP-2細胞。 2．根據(jù)siRNA設(shè)計原則，設(shè)計合成3對靶向MMP-2基因的siRNA（siRNA-1，2，3），采用陽離子脂質(zhì)體試劑瞬時轉(zhuǎn)染食管癌細胞KYSE150，利用熒光定量PCR和Western blot檢測RNA干擾后MMP-2基因的沉

4、默效果，并篩選干擾效果較好的siRNA以及適宜的轉(zhuǎn)染濃度，用于下一步實驗。 3．采用陽離子脂質(zhì)體試劑向食管癌細胞KYSE150轉(zhuǎn)染靶向MMP-2基因的siRNA，下調(diào)MMP-2的表達。于轉(zhuǎn)染siRNA后48小時，應(yīng)用細胞劃痕實驗檢測MMP-2基因表達下調(diào)后食管癌細胞遷移能力的變化；應(yīng)用boyden chamber細胞侵襲實驗檢測MMP-2基因表達下調(diào)后，食管癌細胞KYSE150侵襲能力的改變。 4．采用陽離子脂質(zhì)體試劑向

5、食管癌細胞KYSE150轉(zhuǎn)染靶向MMP-2基因的siRNA，下調(diào)MMP-2的表達。應(yīng)用Affymetrix HU133 plus2基因芯片檢測食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達下調(diào)后，基因表達譜的差異，并應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對相關(guān)基因和信號通路進行綜合分析。 結(jié)果： 1．4種食管癌細胞株均有MMP-2基因表達，其中低分化鱗癌細胞株KYSE150表達水平最高，與其它3種食管癌細胞株比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．01）

6、；食管癌細胞株MMP-2基因表達豐度與食管癌細胞惡性程度有關(guān)，隨著惡性程度的上升MMP-2表達水平升高。 2．3對不同siRNA轉(zhuǎn)染組MMP-2表達在mRNA和蛋白水平均有明顯下調(diào)，其干擾效率分別為siRNA-1（97．7%）、siRNA-2（91．9%）、siRNA-3（94．9%）。其中siRNA-1干擾效率最高，與其它兩組轉(zhuǎn)染siRNA組和空白對照及陰性對照組比較，差異有顯著性（P<0．01）；濃度梯度實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染siR

7、NA為50nM時，干擾效率最高。 3．轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達后，細胞劃痕后24h后空白對照組和陰性對照組細胞劃痕明顯愈合，而siRNA轉(zhuǎn)染組幾乎沒有愈合；48h后空白對照組和陰性對照組已經(jīng)完全愈合，siRNA轉(zhuǎn)染組僅有少量愈合，與其它兩組比較差異顯著（P<0．01）；boyden chamber小室細胞侵襲實驗結(jié)果siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細胞數(shù)明顯減少，與空白對照組和陰性對照組比較，差異有顯著性

8、（P<0．05）。 4．干擾食管癌細胞KYSE150MMP-2基因表達后，基因芯片分析其表達譜的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)330個探針表達明顯改變，對應(yīng)有明確名稱的基因為235個，其中上調(diào)的127個，下調(diào)的108個；EST序列53個，其中上調(diào)17個，下調(diào)36個。共涉及87個信號通路，主要與細胞基質(zhì)黏附、細胞遷移、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、細胞凋亡以及衰老等相關(guān)。 結(jié)論：1．食管癌細胞表達MMP-2與其惡性程度和臨床病理改變相關(guān)，隨惡性

9、程度的升高其表達豐度升高；食管癌細胞KYSE150為MMP-2高表達細胞系，可作為進一步研究的實驗材料。 2．RNA干擾技術(shù)可高效地下調(diào)食管癌細胞KYSE150MMP-2基因的表達，可作為一種基因治療的策略深入研究。 3．食管癌細胞KYSE150MMP-2基因下調(diào)后，細胞遷移和侵襲能力顯著被抑制，表明MMP-2可作為食管癌基因治療的靶點。 4．食管癌細胞KYSE150MMP-2基因下調(diào)后，其細胞基因表達譜有明顯變