干濕交替誘導(dǎo)水稻根表紅棕色鐵膜形成的生理與分子機理.pdf

1、干濕交替是協(xié)調(diào)水稻根際水分與氧氣供應(yīng)的一種重要農(nóng)藝措施。干濕交替在稻田中的應(yīng)用，能夠顯著提高水稻的根系活力，有利于水稻高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的形成。根表鐵膜是水稻適應(yīng)逆境環(huán)境下形成的天然屏障，對促進營養(yǎng)元素的高效吸收和阻隔有害重金屬元素向稻米籽粒運輸發(fā)揮著重要作用。在稻田進行干濕交替灌溉過程中，水稻根表也會形成鐵膜。然而，干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的生理與分子機理并不清楚。本文從鐵膜的組成與影響因素出發(fā)，探討了干濕交替影響根表紅棕色鐵膜形成

2、的生理過程、根系基因差異表達(dá)譜和根表紅棕色鐵膜形成的分子機理。具體研究結(jié)果如下：
　　（1）化學(xué)分析表明，根表鐵膜主要由無定型態(tài)和結(jié)晶態(tài)鐵組成，占根表總鐵的84％以上，且主要以Fe3+為主，占70%以上。正常磷處理條件下，水稻根表鐵礦物主要以磷酸鐵為主；缺磷處理條件下，水稻根表鐵礦物主要以氧化鐵或氫氧化鐵為主。水稻根表鐵膜由紅棕色鐵膜和非紅棕色鐵膜組成。磷素、特別是磷鐵比顯著影響根表紅棕色和非紅棕色鐵膜的形成。當(dāng)磷鐵比小于1:3時

3、，隨著根際磷鐵比的降低，根表紅棕色鐵膜數(shù)量增加。
　?。?）干濕交替促進根際氧化還原電位（Eh）的上升，Eh值從314.2 mV上升到529.5 mV；降低pH值，pH值從5.53下降到3.43；且干濕交替降低溶液中Fe2+濃度，其值從310.6μmol/L下降到31.5μmol/L。
　　（3）不同干濕交替強度和次數(shù)處理表明，干濕交替強度為12 h干旱和12 h淹水處理、且干濕交替處理5次時，水稻根系氧化力最大，達(dá)1036

4、.73μg/h/g DW，比長期淹水對照增加了16.8%。干濕交替處理明顯增加水稻根系抗氧化酶活性，隨著干濕交替處理次數(shù)的增加，根系抗氧化酶活性如超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）分別比對照增加了24.6-38.4%、22.2-27.1%、21.2-21.5%和3.6-10.4%；根系內(nèi)源氧化性物質(zhì)如超氧陰離子（O2-·）和過氧化氫（H2O2）含量分別比對照增加了14.5-

5、30.0%和29.0-35.7%。
　?。?）為了研究H2O2在鐵膜形成過程中的作用，研究了H2O2抑制劑（DMTU：二甲基硫脲，為H2O2清除劑；CAT：過氧化氫酶，為H2O2水解酶；AT：3-氨基-1，2，4-三唑，為CAT抑制劑）對水稻根表鐵膜形成的影響。結(jié)果表明，DMTU處理的水稻根系內(nèi) H2O2含量、根系氧化力和根表DCB-Fe數(shù)量分別比不加抑制劑處理的相應(yīng)值降低了27.2%、19.8%和18.4%；AT處理的水稻根系H

6、2O2含量、根系氧化力和根表DCB-Fe數(shù)量則分別增加了31.8%、22.8%和26.7%；外源CAT添加處理降低了根表氧化性物質(zhì)，DCB-Fe的數(shù)量減少了24.5%。
　　（5）為了探究H2O2的可能來源，我們對長期淹水（CK）、干濕交替（AWD）、長期淹水加Fe2+（CK+Fe）和干濕交替加Fe2+（AWD+Fe）處理條件下的水稻根系進行了基因差異表達(dá)譜分析。我們對四個數(shù)據(jù)庫（AWD/CK、(AWD+Fe)/(CK+Fe)、(

7、CK+Fe)/CK和(AWD+Fe)/AWD）進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，有3822個差異表達(dá)基因參與了干濕交替和鐵膜的形成過程。其中，AWD/CK（506上調(diào)和687下調(diào)）中的差異表達(dá)基因多于(AWD+Fe)/(CK+Fe)（308上調(diào)和179下調(diào)），表明鐵膜形成后會恢復(fù)部分基因的表達(dá)水平。與AWD/CK和AWD+Fe/AWD處理相比，(CK+Fe)/CK（728上調(diào)和1175下調(diào)）和(AWD+Fe)/AWD（1252上調(diào)和1189下調(diào)）有較多

8、的差異表達(dá)基因。
　?。?）利用GO（Gene Ontology）對四個數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)基因進行功能分類，發(fā)現(xiàn)有270個差異表達(dá)基因參與了氧化還原反應(yīng)過程，165個差異表達(dá)基因與氧化還原酶功能有關(guān)。利用KEGG（KyotoEncyclopedia ofGenes andGenomes）對四個數(shù)據(jù)庫中的差異表達(dá)基因進行生物通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要分布在代謝通路、生物合成通路、光合作用通路、信號刺激通路和細(xì)胞器通路。利

9、用維恩圖分析差異表達(dá)基因的整體分布，發(fā)現(xiàn)四個數(shù)據(jù)庫中有38個共同差異表達(dá)基因，這些基因的蛋白注釋，表明它們與水稻抗病性、抗旱性、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、氧化還原、蛋白激酶和轉(zhuǎn)運、新陳代謝過程有關(guān)。AWD與CK相比，氧化還原反應(yīng)過程中差異表達(dá)基因最多，達(dá)102個基因，占總差異表達(dá)基因數(shù)的8.25%，其中30個基因上調(diào)表達(dá)，72個基因下調(diào)表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果與基因表達(dá)譜分析結(jié)果基本一致，兩者的線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.90。干濕交替處

10、理促進了水稻根系乙醇酸氧化酶基因（OsGLO）的表達(dá)，水稻根系OsGLO3和OsGLO4表達(dá)量分別是對照的2.2倍和2.7倍，表明，OsGLO參與了氧化還原反應(yīng)過程，OsGLO可能受干濕交替誘導(dǎo)。
　　（7）OsGLO生物信息學(xué)分析表明，OsGLO家族有6個成員，其中 OsGLO1、OsGLO3、OsGLO4和OsGLO5編碼蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域類似。除了OsGLO5外，OsGLO1、OsGLO3和OsGLO4的氨基酸序列和核酸序

11、列相似性均大于70%，并且具有較高的同源性和較近的進化程度。OsGLO1和OsGLO4編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)基本相似，且兩者在各組織中的表達(dá)豐度相對較高。有趣的是，OsGLO4在水稻根和莖中表達(dá)豐度最高，是OsGLO1的1.36倍。因此，在下述試驗中，我們選擇了OsGLO4基因作為研究對象。
　?。?）為了研究OsGLO4基因在水稻根表鐵膜形成過程中的影響，通過合作研究，我們獲得了水稻OsGLO4基因的干涉材料（OsGLO4-RNA

12、i）和超表達(dá)材料（OsGLO4-OX）。結(jié)果表明，在正常生長條件下，與WT相比，OsGLO4-RNAi水稻根系中OsGLO4基因表達(dá)量、乙醇酸氧化酶活性和DCB-Fe含量分別下降了35.6%、70.9%和16.5%。OsGLO4-OX水稻OsGLO4基因表達(dá)量、乙醇酸氧化酶活性和DCB-Fe含量分別上升了103.4%、101.6%和15.2%。利用GLC（乙醇酸，乙醇酸氧化酶促進劑）和HPMS（α-羥基-2-吡啶甲磺酸，乙醇酸氧化酶抑制

13、劑）對OsGLO4-OX水稻根表鐵膜進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，GLC處理水稻根表鐵膜數(shù)量增加了10.9%，HPMS處理水稻根表鐵膜下降了29.7%，表明，水稻OsGLO4基因調(diào)控了根表鐵膜的形成。
　?。?）另外，我們還研究了DMTU和AT對WT和OsGLO4-OX材料根表鐵膜數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不加抑制劑處理相比，DMTU處理的WT和OsGLO4-OX材料根表DCB-Fe分別下降了17.5%和18.4%；AT處理水稻根

14、表DCB-Fe分別增加了23.4%和25.7%。正常處理的水稻根系基部H2O2含量比根尖增加了72.6%，其CAT活性比根尖下降了32.3%，且根基部有大量紅棕色鐵膜，而根尖無明顯紅棕色鐵膜出現(xiàn)；AT處理的水稻根系基部H2O2含量與根尖相比下降了28.0%，根基部紅棕色鐵膜明顯少于根尖。隨著干濕交替次數(shù)的增加，根系OsGLO4基因表達(dá)量逐漸增加，乙醇酸氧化酶活性最大增加了55.9%，H2O2熒光染色顯示，干濕交替誘導(dǎo)了大量的H2O2在根