siRNA靶向干擾VEGF-C對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤微環(huán)境的影響.pdf

1、目的：乳腺癌組織內(nèi)的微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的必要物質(zhì)基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)能夠在腫瘤微環(huán)境中引起微淋巴管的生成，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)免疫耐受，然而VEGF-C對(duì)乳腺癌腫瘤微環(huán)境的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究以小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞和樹突細(xì)胞為切入點(diǎn)，采用RNAi方法干擾VEGF-C表達(dá)，通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)，從分子、細(xì)胞及動(dòng)物整體水平探討VEGF-C與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系及其作用機(jī)制。
　　方法

2、：⑴體外實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)、化學(xué)合成三對(duì)靶向小鼠 VEGF-C的 siRNA，在細(xì)胞水平應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑將三對(duì)siRNA分別轉(zhuǎn)染到4T1細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，提取出細(xì)胞內(nèi)的mRNA與蛋白，使用RT-PCR與Western blot方法檢測(cè)VEGF-C的表達(dá)水平，篩選出沉默效率最高的一對(duì)siRNA；隨后在體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，采用 MTT比色法、Hochest33258熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向干擾VEGF-C對(duì)4T1小鼠乳

3、腺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和凋亡的影響；應(yīng)用RT-PCR、ELISA與Western blotting方法檢測(cè)靶向干擾VEGF-C對(duì)于4T1細(xì)胞CCR7、CCL21、VEGFR-3、KLF-2與survivin的表達(dá)水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平的影響；體外培養(yǎng)從小鼠股骨中分離培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾小鼠樹突狀細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)，應(yīng)用ELISA、RT-PCR、Western blot

4、ting方法檢測(cè)鼠DC細(xì)胞VEGF-C、VEGFR-3、KLF-2與survivin的表達(dá)水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)與MLR技術(shù)檢測(cè)小鼠樹突狀細(xì)胞表型、凋亡與刺激同種異型淋巴細(xì)胞的能力變化。⑵體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：用4T1細(xì)胞接種于Balb/c小鼠的皮下，建立荷瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行瘤內(nèi)藥物注射，觀察靶向干擾VEGF-C對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。瘤內(nèi)注射結(jié)束后，處死小鼠，TUNEL染色檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡狀況

5、；ELISA法檢測(cè)腫瘤組織中VEGF-C與CCL21蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)瘤內(nèi)侵潤(rùn)DC與Treg細(xì)胞的分布狀況；應(yīng)用免疫組化法與ELISA方法檢測(cè)瘤組織內(nèi)VEGF-C、pAKT、KLF-2、Survivin和VEGFR-3蛋白的表達(dá)以及微淋巴管密度，探討靶向干擾VEGF-C的體內(nèi)抗腫瘤作用及其對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響機(jī)制。
　　結(jié)果：①體外實(shí)驗(yàn)：RT-PCR與Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示設(shè)計(jì)合成的三對(duì)siRNA中，siV

6、2轉(zhuǎn)染對(duì)4T1細(xì)胞的VEGF-C沉默效率最高；100nM濃度的siV2轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞48小時(shí)后，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示4T1細(xì)胞中的VEGF-C、VEGFR-3、pAKT、KLF-2及Survivin的mRNA與蛋白表達(dá)均顯著下降而活化Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加；ELISA結(jié)果顯示4T1細(xì)胞上清中VEGF-C與CCL21濃度明顯降低；MTT結(jié)果顯示4T1細(xì)胞增殖顯著降低；Hochest33258染色結(jié)果顯

7、示4T1細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示4T1細(xì)胞的凋亡率顯著增加而CCR7表達(dá)顯著下調(diào)；細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)顯示4T1細(xì)胞的遷移能力顯著降低。siV2轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞48小時(shí)后，ELISA結(jié)果顯示小鼠DC培養(yǎng)上清中VEGF-C濃度明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示小鼠DC的凋亡率明顯增加；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示小鼠DC的VEGF-C、VEGFR-3、pAKT、KLF-2及Survivin表達(dá)均顯著降低而活化

8、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加。LPS刺激24小時(shí)后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示siV2轉(zhuǎn)染小鼠DC的CD86、I-Ad與CCR7表達(dá)明顯低于對(duì)照組,而CD80表達(dá)卻無(wú)明顯差異;MLR結(jié)果顯示siV2轉(zhuǎn)染小鼠DC的刺激同種異型淋巴細(xì)胞的能力顯著降低。②體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白組及平行對(duì)照組相比較：siV2瘤內(nèi)注射能夠明顯抑制移植瘤的增長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移；TUNEL染色結(jié)果顯示腫瘤組織中凋亡細(xì)胞明顯增多；免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)VE

9、GF-C、pAKT、KLF-2、Survivin及VEGFR3蛋白表達(dá)與微淋巴管密度明顯降低；ELISA結(jié)果顯示腫瘤組織中VEGF-C與CCL21表達(dá)明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的樹突狀細(xì)胞及Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少，腫瘤細(xì)胞與浸潤(rùn)樹突細(xì)胞的CCR7表達(dá)均明顯降低，浸潤(rùn)樹突細(xì)胞的CD80、CD86、I-Ad表達(dá)組間無(wú)明顯差異，但表達(dá)率均低于成熟DC。
　　結(jié)論：VEGF-C干擾可以在體內(nèi)外下調(diào)4T1細(xì)胞的CCR7與CCL

10、21表達(dá)、抑制4T1細(xì)胞的增殖、促進(jìn)4T1細(xì)胞的凋亡；VEGF-C干擾可以在體外抑制小鼠樹突狀細(xì)胞的成熟、促進(jìn)小鼠樹突狀細(xì)胞的凋亡、在體內(nèi)外水平降低小鼠樹突狀細(xì)胞CCR7的表達(dá)；VEGF-C干擾能夠在體內(nèi)水平抑制小鼠乳腺癌腫瘤的增長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移，并能夠降低腫瘤微環(huán)境中Treg與幼稚DC的數(shù)目及微淋巴管密度。該作用機(jī)制可能與VEGF-C表達(dá)沉默后，VEGFR-3表達(dá)降低，胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路中的AKT磷酸化水平降低，以及凋亡抑制蛋白s