外照射聯(lián)合靶向治療的實驗研究.pdf

1、癌癥仍是目前威脅人類生命健康的重要疾病之一。放射治療是傳統(tǒng)且有效的治療手段之一。近年放療技術不斷改進，開展了三維適形放療、調強放療、圖像引導放療和Tomotherapy等，這些技術都提高了放射治療的有效率。但是因腫瘤類型、分期、靶區(qū)內正常組織的劑量限制、微轉移灶、放療后產(chǎn)生乏氧和抵抗等因素一定程度上限制了其療效。 隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，人們在不斷探索癌癥分子生物學發(fā)病機制的同時，意識到如果能夠針對癌癥的特異性變化進行治

2、療，將會大大改善治療效果。因此靶向治療應運而生。它以腫瘤細胞的特異性改變?yōu)樽饔冒悬c，是一種有的放矢的治療方法。 放射免疫治療是靶向治療的一種。它集免疫學、放射生物學、腫瘤放射治療學、腫瘤內科學和核醫(yī)學為一身的腫瘤治療方式。其利用靶向抗體攜帶的核素發(fā)出的射線持續(xù)照射腫瘤細胞，因此對腫瘤微轉移灶及乏氧、射線抵抗細胞有一定的優(yōu)勢。雖然其在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了令人鼓舞的結果，但是單獨治療實體瘤時，靶區(qū)劑量遠遠達不到治療劑量，因而限

3、制了其在實體瘤中的應用。 溶瘤病毒治療是利用基因工程改造的病毒在特異的腫瘤細胞中復制并溶解細胞，釋放出來的子代病毒繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞周而復始殺滅腫瘤。雖然單一病毒治療在體外實驗中有效，但是臨床療效并不令人滿意。但有資料表明，聯(lián)合放化療后可增加治療效果。 合理、有計劃的綜合治療可以充分利用和發(fā)揮各種治療手段的優(yōu)缺點。因此本實驗擬通過體內/外實驗研究放免新藥碘[131I]標記的腫瘤細胞核人鼠嵌合單抗(131I-chTNT

4、)和條件復制溶瘤病毒Ad-MK聯(lián)合放療后對腫瘤的影響，希望能夠為臨床的合理應用提供有益的借鑒。 第一部分外照射聯(lián)合碘[131I]標記的腫瘤細胞核人鼠嵌合單抗對C57BL/6小鼠Lewis瘤影響的實驗研究 目的：研究外照射聯(lián)合不同途徑注射碘[131I]標記的腫瘤細胞核人鼠嵌合單抗(131I-chTNT)對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響并觀察131I-chTNT在小鼠體內的分布和顯像。 方法：建立C57BL/6近交系小鼠Le

5、wis瘤模型，當接種于右后肢的腫瘤直徑達指定大小時隨機分組進行實驗。體內分布和活體顯像實驗分為兩組：①單藥組：靜脈或瘤內給藥；②聯(lián)合組：外照射15Gy 24小時后再以不同途徑給藥。分別于給藥后不同時間測量腫瘤組織及感興趣器官的放射性，并觀察活體顯像情況。荷瘤小鼠腫瘤生長效應實驗分為四組：①空白對照組；②單藥組：靜脈或瘤內給藥；③照射組：外照射15Gy；④聯(lián)合組：外照射15Gy 24小時后再以不同途徑給藥。觀察指標為腫瘤生長延遲時間。

6、 結果：(1)外照射聯(lián)合尾靜脈注射131I-chTNT荷瘤小鼠體內分布實驗中單藥組和聯(lián)合組腫瘤組織的放射性在給藥24小時最高，聯(lián)合組高于單藥組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)，直至72小時、120小時聯(lián)合組腫瘤組織放射性仍高于單藥組，P值分別為0.041、0.024。兩組中正常組織的放射性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；铙w核素顯像中兩組均在給藥3天時腫瘤區(qū)放射性濃聚最集中，持續(xù)至7天仍可見腫瘤影像。聯(lián)合組腫瘤區(qū)比單藥組

7、的濃聚強且持續(xù)時間長。荷瘤小鼠腫瘤生長效應實驗表明：單藥組、外照射組、聯(lián)合組的絕對延遲時間分別為(3.1±1.75)天、(9.1±1.86)天和(13.1±2.6)天，標準化延遲時間為10天，131I-chTNT對放射的增益因子為1.08。 (2) 外照射聯(lián)合瘤內注射碘131I-chTNT的荷瘤小鼠體內分布實驗中單藥組和聯(lián)合組腫瘤組織的放射性均在給藥24小時最高，聯(lián)合組高于單藥組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.023)，直至7

8、2小時聯(lián)合組腫瘤組織放射性仍高于單藥組(P=0.038)。兩組中正常組織的放射性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；铙w核素顯像中兩組均在給藥1天時腫瘤區(qū)濃聚最高，至7天仍可見腫瘤影像。聯(lián)合組比單藥組腫瘤區(qū)放射性濃聚強而且持續(xù)時間長。荷瘤小鼠腫瘤生長效應實驗表明：單藥組、外照射組、聯(lián)合組的的絕對延遲時間分別為(3.3±1.75)天、(6.0±2.02)天和(9.5±1.93)天，標準化延遲時間為6.2天，131I-chTNT對放射的增益因

9、子為1.03。 結論：外照射聯(lián)合靜脈和瘤內注射131I-chTNT后可促進乃131I-chTNT在荷瘤小鼠體內腫瘤區(qū)的濃聚，但不增加對正常組織的影響。二者聯(lián)合應用時131I-chTNT可提高外照射對荷瘤小鼠的放射效應。 第二部分外照射及絲裂霉素聯(lián)合復制型溶瘤腺病毒Ad-MK對膀胱癌細胞的作用 目的：以Midkine(MK)基因作為特異啟動子的條件復制溶瘤腺病毒Ad-MK可在MK mRNA高表達的腫瘤細胞中特異性的

10、復制而殺滅腫瘤。本實驗擬探討膀胱癌細胞中MK mRNA的表達，進而研究Ad-MK對膀胱癌細胞增殖的影響以及聯(lián)合放療、絲裂霉素后對細胞的作用，為臨床膀胱癌綜合治療提供細胞學基礎。 方法：應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細胞癌細胞株BIU-87、EJ中MK mRNA的表達及Ad-MK感染細胞后，細胞中腺病毒Ela mRNA的表達。采用倒置顯微鏡觀察條件復制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于膀胱癌細胞

11、后細胞形態(tài)學的改變。采用MTT(四甲基偶氮唑藍)比色法檢測Ad-MK聯(lián)合絲裂霉素后對膀胱癌細胞BIU-87的作用，通過計算相互作用指數(shù)CDI數(shù)值觀察兩者聯(lián)合是否有協(xié)同作用。細胞存活率檢測Ad-MK對膀胱癌細胞BIU-87放射敏感性的影響。通過病毒復制量的測定觀察外照射及絲裂霉素對溶瘤腺病毒Ad-MK在膀胱癌細胞BIU-87中復制的影響。 結果：淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細胞癌細胞株BIU-87、EJ中均可見MK mRNA的表達。

12、條件復制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于BIU-87細胞后，引起細胞形態(tài)學的改變。細胞變圓，膨脹，懸浮，胞漿中出現(xiàn)空泡。之后細胞裂解。其形態(tài)學改變有時間性變化。最后細胞數(shù)量逐漸減少。Ad-MK感染BIU-87細胞后，RT-PCR可檢測到細胞中Ela mRNA的表達。Ad-MK對BIU-87細胞的增殖抑制作用呈明顯的量效、時效關系。隨著濃度的增加及時間的延長對細胞的抑制作用逐漸增加。與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Ad-MK聯(lián)合

13、低劑量絲裂霉素(50μg/L)后對BIU-87細胞生長的抑制作用明顯增加，與單用Ad-MK或MMC組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。數(shù)據(jù)分析顯示CDI<1，則表示兩者聯(lián)合使用對BIU-87細胞有協(xié)同作用。4Gy照射BIU-87細胞的存活率為0.11±0.013，0.1MOI Ad-MK處理BIU-87細胞的存活率為0.13±0.004，4Gy聯(lián)合0.1MOIAd-MK后細胞存活率為0.003±0.002。聯(lián)合組細胞的存活率與單用

14、Ad-MK或放療相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。通過對病毒復制量的測定發(fā)現(xiàn)低劑量放療和MMC聯(lián)合病毒治療后，并未減少病毒在細胞中的復制。與單獨病毒感染組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論:淺表型和惡性浸潤性膀胱移行細胞癌細胞株BIU-87、EJ兩種細胞系中均有MK mRNA的表達；采用RT-PCR技術可檢測到受病毒感染的細胞中有病毒Ela mRNA的表達，說明Ad-MK在膀胱癌細胞中進行了復制。這個結果

15、也提示，在形態(tài)學觀察和MTT實驗中觀察到的Ad-MK對膀胱癌細胞的殺傷作用是由于病毒在細胞中選擇性復制引起的。條件復制型溶瘤腺病毒Ad-MK對膀胱癌細胞BIU-87細胞的增殖抑制作用呈量效和時效關系。放療和絲裂霉素能增強Ad-MK的細胞毒作用，并能增加病毒在細胞中的復制。 第三部分膀胱移行細胞癌中MK蛋白表達與其對應的臨床病理特征及預后的關系 目的：研究中期因子(midkine，MK)在膀胱移行細胞癌組織中的表達，探討其

16、與膀胱癌對應的臨床病理特征及與術后患者預后的關系，探討該因子成為膀胱癌分子標志物、預后分析指標及靶向治療靶點的可能性。 方法：采用SP免疫組化染色法檢測50例手術切除的人膀胱移行細胞癌組織和10例正常膀胱粘膜中MK蛋白的表達，分析MK蛋白在膀胱移行細胞癌組織中的表達與其臨床對應的各項病理參數(shù)的關系，對其中40例有隨訪資料者的MK蛋白表達與預后的關系進行統(tǒng)計學分析。 結果：MK蛋白主要定位于腫瘤細胞的細胞質和細胞膜中。在人

17、膀胱移行細胞癌組織中MK蛋白的表達率為90％(45/50)，在正常膀胱組織中無表達或弱表達；膀胱移行細胞癌中隨腫瘤浸潤深度和分級的增加，MK蛋白的表達逐步增強(P值分別為0.043、0.003)。而MK蛋白表達與性別、腫瘤大小、數(shù)目、初復治無相關(P值分別為0.466、0.229、0.837、0.785)。生存分析表明MK蛋白低表達組1、3、5年生存率分別81.8％、81.8％、72.7％，MK蛋白高表達組1、3、5年生存率分別63.6

18、％、36.4％、18.2％，MK蛋白低表達組生存率顯著低于高表達組，兩組間生存率的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論：MK蛋白在人膀胱移行細胞癌組織中高表達，在正常膀胱粘膜上皮無或弱表達。MK蛋白表達隨腫瘤分期和分級的增加表達逐步增強，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、數(shù)目、初復治無相關。MK蛋白表達與膀胱移行細胞癌術后患者的預后相關，MK蛋白呈高表達者的生存時間比低表達者短。因此MK有可能成為膀胱移行細胞癌有價值的分子標志