2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、陸地棉(Gossypium hirsutum)是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,是人類獲取天然纖維的主要來(lái)源。類黃酮物質(zhì)(Flavonoids)是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,參與植物組織顏色的形成、花粉發(fā)育、植物激素的運(yùn)輸以及抗逆反應(yīng),在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有非常重要的作用。查耳酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)催化從查耳酮到黃烷酮的異構(gòu)反應(yīng),是類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。
  為研究

2、查耳酮異構(gòu)酶對(duì)類黃酮合成及棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響,本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,克隆了查耳酮異構(gòu)酶基因(GhCHI-A、GhCHI-D),通過(guò)原核表達(dá),分析了相應(yīng)蛋白的催化酶活特性;并進(jìn)一步通過(guò)在棉花(冀棉14,J14)中抑制和上調(diào)GhCHI-A基因的表達(dá),研究了GhCHI在棉花類黃酮合成途徑中及生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。
  主要結(jié)果如下:
  1.陸地棉中存在兩個(gè)I型CHI蛋白
  以擬南芥AtCHI基因?yàn)樘结樞蛄校诋愒此?/p>

3、倍體陸地棉(AADD)基因組中查找同源序列,共獲得14個(gè)CHI同源蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,這14個(gè)蛋白分列于3類CHI蛋白,其中有2個(gè)(GhA_13G0197和GhD_13G0211)屬于I型CHI蛋白。這兩個(gè)CHI蛋白與I型CHI具有高度的序列相似性,具有完整的底物結(jié)合和活性中心保守氨基酸殘基,以及I型CHI蛋白的底物特異氨基酸殘基。這兩個(gè)基因在基因結(jié)構(gòu)和序列上均分別與亞洲棉(AA)和雷蒙德氏棉(DD)的同源基因接近,分別命名為GhC

4、HI-A和GhCHI-D。
  通過(guò)qRT-RCR檢測(cè)了這兩個(gè)基因的表達(dá)水平,表明這兩個(gè)基因在棉花各個(gè)組織中均有一定程度的表達(dá),其中在葉片和胚珠的表達(dá)水平最高,但在開(kāi)花后20天和25天的纖維中幾乎沒(méi)有表達(dá);進(jìn)一步分析表明,在生長(zhǎng)階段的棉花葉片中(Half expansion leaf,HL)的表達(dá)水平較高。
  2.棉花GhCHI蛋白的酶活檢測(cè)
  為確定GhCHI蛋白的催化活性,構(gòu)建了pET-28a-GhCHI-A/

5、D蛋白表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,在大腸桿菌E.coli中誘導(dǎo)出了目的蛋白,純化得到了相應(yīng)的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)表明GhCHI-A和 GhCHI-D重組蛋白均能在體外催化查耳酮異構(gòu)為柚皮素,但均沒(méi)有檢測(cè)到催化柚皮素轉(zhuǎn)化為查耳酮的活性;其最適反應(yīng)pH均為8.0,最適反應(yīng)溫度均為37℃。在最適反應(yīng)條件下,這兩個(gè)蛋白的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)稍有差別,其中GhCHI-A重組蛋白的Km=133.75nM,Vmax=0.0137nM/min;GhCHI-D重組蛋白

6、的Km=211.10nM,Vmax=0.0226nM/min。這些結(jié)果表明GhCHI-A和GhCHI-D蛋白均是具有催化活性的I型CHI蛋白。
  3.GhCHI-A影響棉花類黃酮的積累
  為探究GhCHI在類黃酮合成途徑中的功能,構(gòu)建了GhCHI-A RNAi干擾載體和GhCHI-A超量表達(dá)載體,通過(guò)棉花遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入陸地棉(J14),經(jīng)組織染色鑒定、自交,分別獲得了純合的轉(zhuǎn)基因植株。GhCHI基因在GhCHI-A RNA

7、i抑制植株中的表達(dá)水平顯著降低,在GhCHI-A超量表達(dá)植株中的表達(dá)量均相對(duì)野生型提高了10倍以上;同時(shí),酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNAi抑制棉花體內(nèi)CHI酶活顯著降低,而超量表達(dá)植株中CHI酶活略有升高。通過(guò)類黃酮含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RNAi抑制植株的葉片、花瓣(開(kāi)花當(dāng)天和開(kāi)花后1天)的花色素含量顯著增加,幼嫩根尖區(qū)域的槲皮素含量、種子中原花色素(PAs)含量提高;而超量表達(dá)植株與對(duì)照植株相比,葉片、花瓣(0dpa)的花色素含量顯著降低,根尖區(qū)域的槲皮

8、素含量以及PAs含量沒(méi)有明顯變化。表明下調(diào)GhCHI-A基因的表達(dá)可以促進(jìn)棉花的花色素、槲皮素等類黃酮的積累,而上調(diào)表達(dá)該基因卻抑制了葉片中花色素的積累。
  4.調(diào)控GhCHI-A基因的表達(dá)影響棉花的生長(zhǎng)發(fā)育
  為探索GhCHI對(duì)棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響,比較了不同轉(zhuǎn)基因材料和對(duì)照材料在植株生長(zhǎng)、種子和纖維性狀方面的差異。通過(guò)觀察分析發(fā)現(xiàn),RNAi抑制植株嚴(yán)重矮化,植株高度降低了15.5%,種子百粒重下降了20%,衣分提高了1

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